Javascript je trenutno onemogućen u vašem pretraživaču.Kada je javascript onemogućen, neke funkcije ove web stranice neće raditi.
Registrirajte svoje specifične podatke i određene lijekove od interesa, a mi ćemo uskladiti informacije koje nam date sa člancima u našoj opsežnoj bazi podataka i poslati vam PDF kopiju putem e-pošte na vrijeme.
Jesu li manje nanočestice uvijek bolje?Razumjeti biološke efekte agregacije srebrnih nanočestica ovisno o veličini u biološki relevantnim uvjetima
Autori: Bélteky P, Rónavári A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Konya Z
Péter Bélteky,1,* Andrea Rónavári,1,* Dalma Zakupszky,1 Eszter Boka,1 Nóra Igaz,2 Bettina Szerencsés,3 Ilona Pfeiffer,3 Csaba Vágvölgyi,3 Mónika Kiricsi iz Hemije okoliša, Hungary of Science of Environmental and Hungary Fakultet informatike , Univerzitet u Segedinu;2 Katedra za biohemiju i molekularnu biologiju, Fakultet nauke i informisanja, Univerzitet u Segedinu, Mađarska;3 Odsek za mikrobiologiju, Fakultet nauke i informisanja, Univerzitet u Segedinu, Mađarska;4MTA-SZTE Reaction Kinetics and Surface Chemistry Research Group, Szeged, Mađarska* Ovi autori su podjednako doprinijeli ovom radu.Komunikacija: Zoltán Kónya Odsjek za primijenjenu hemiju i hemiju okoliša, Fakultet nauke i informatike, Univerzitet u Segedinu, Rerrichov trg 1, Segedin, H-6720, Mađarska Telefon +36 62 544620 Email [Zaštita e-pošte] Namjena: Srebrne nanočestice su (AgNP) jedan od najčešće proučavanih nanomaterijala, posebno zbog njihove biomedicinske primjene.Međutim, zbog agregacije nanočestica, njihova odlična citotoksičnost i antibakterijska aktivnost često su ugroženi u biološkim medijima.U ovom radu proučavano je ponašanje agregacije i srodne biološke aktivnosti tri različita uzorka nanočestica srebra sa završnim citratom prosječnog prečnika 10, 20 i 50 nm.Metoda: Koristiti transmisioni elektronski mikroskop za sintetizaciju i karakterizaciju nanočestica, procijeniti njihovo ponašanje agregacije pri različitim pH vrijednostima, koncentracijama NaCl, glukoze i glutamina dinamičkim raspršivanjem svjetlosti i ultraljubičastom vidljivom spektroskopijom.Pored toga, komponente medijuma stanične kulture, kao što je Dulbecco, poboljšavaju ponašanje agregacije u Eagle Medium-u i Fetalnom telećem serumu.Rezultati: Rezultati pokazuju da kiseli pH i fiziološki sadržaj elektrolita općenito izazivaju agregaciju mikrona, što može biti posredovano stvaranjem biomolekularne korone.Vrijedi napomenuti da veće čestice pokazuju veću otpornost na vanjske utjecaje od njihovih manjih parnjaka.In vitro citotoksični i antibakterijski testovi izvedeni su tretiranjem ćelija agregatima nanočestica u različitim fazama agregacije.Zaključak: Naši rezultati otkrivaju duboku korelaciju između koloidne stabilnosti i toksičnosti AgNP-a, jer ekstremna agregacija dovodi do potpunog gubitka biološke aktivnosti.Veći stepen antiagregacije uočen za veće čestice ima značajan uticaj na in vitro toksičnost, jer takvi uzorci zadržavaju više antimikrobne i aktivnosti ćelija sisara.Ovi nalazi dovode do zaključka da, uprkos opštem mišljenju u relevantnoj literaturi, ciljanje na najmanje moguće nanočestice možda nije najbolji pravac delovanja.Ključne riječi: rast posredovan sjemenom, koloidna stabilnost, ponašanje agregacije ovisno o veličini, toksičnost oštećenja agregacije
Kako potražnja i proizvodnja nanomaterijala nastavljaju rasti, sve se više pažnje poklanja njihovoj biološkoj sigurnosti ili biološkoj aktivnosti.Srebrne nanočestice (AgNP) su jedni od najčešće sintetizovanih, istraživanih i korišćenih predstavnika ove klase materijala zbog svojih odličnih katalitičkih, optičkih i bioloških svojstava.1 Općenito se vjeruje da se jedinstvene karakteristike nanomaterijala (uključujući AgNP) uglavnom pripisuju njihovoj velikoj specifičnoj površini.Stoga je neizbježan problem bilo koji proces koji utiče na ovu ključnu osobinu, kao što je veličina čestica, površinski premaz ili agregacija, da li će ozbiljno oštetiti svojstva nanočestica koja su kritična za specifične primjene.
Efekti veličine čestica i stabilizatora su teme koje su relativno dobro dokumentovane u literaturi.Na primjer, općenito prihvaćen stav je da su manje nanočestice toksičnije od većih nanočestica.2 U skladu s općom literaturom, naše prethodne studije su pokazale aktivnost nanosrebra ovisno o veličini na stanicama i mikroorganizmima sisara.3– 5 Površinski premaz je još jedan atribut koji ima širok utjecaj na svojstva nanomaterijala.Samo dodavanjem ili modifikacijom stabilizatora na svojoj površini, isti nanomaterijal može imati potpuno različita fizička, hemijska i biološka svojstva.Primjena agensa za zatvaranje najčešće se izvodi u sklopu sinteze nanočestica.Na primjer, nanočestice srebra završene citratom su jedan od najrelevantnijih AgNP-a u istraživanju, koji se sintetiziraju redukcijom soli srebra u odabranoj otopini stabilizatora kao reakcijskom mediju.6 Citrat može lako iskoristiti svoju nisku cijenu, dostupnost, biokompatibilnost i jak afinitet za srebro, što se može odraziti u različitim predloženim interakcijama, od reverzibilne površinske adsorpcije do jonskih interakcija.Male molekule i poliatomski joni blizu 7,8, kao što su citrati, polimeri, polielektroliti i biološki agensi, također se obično koriste za stabilizaciju nano-srebra i izvođenje jedinstvenih funkcionalizacija na njemu.9-12
Iako je mogućnost promjene aktivnosti nanočestica namjernim površinskim zatvaranjem vrlo zanimljivo područje, glavna uloga ovog površinskog premaza je zanemarljiva, osiguravajući koloidnu stabilnost za sistem nanočestica.Velika specifična površina nanomaterijala će proizvesti veliku površinsku energiju, što ometa termodinamičku sposobnost sistema da dostigne svoju minimalnu energiju.13 Bez odgovarajuće stabilizacije, to može dovesti do aglomeracije nanomaterijala.Agregacija je formiranje agregata čestica različitih oblika i veličina koje nastaje kada se dispergovane čestice sretnu i trenutne termodinamičke interakcije omogućavaju česticama da se prianjaju jedna za drugu.Stoga se stabilizatori koriste za sprječavanje agregacije uvođenjem dovoljno velike sile odbijanja između čestica kako bi se spriječilo njihovo termodinamičko privlačenje.14
Iako je predmet veličine čestica i pokrivenosti površine temeljito istražen u kontekstu njegove regulacije bioloških aktivnosti koje pokreću nanočestice, agregacija čestica je uglavnom zanemareno područje.Gotovo da ne postoji temeljna studija za rješavanje koloidne stabilnosti nanočestica u biološki relevantnim uvjetima.10,15-17 Osim toga, ovaj doprinos je posebno rijedak, gdje je toksičnost povezana sa agregacijom također proučavana, čak i ako može uzrokovati neželjene reakcije, kao što je vaskularna tromboza, ili gubitak željenih karakteristika, kao što je njegova toksičnost, kao što je prikazano na slici 1.18, prikazano 19.Zapravo, jedan od rijetkih poznatih mehanizama otpornosti na nanočestice srebra povezan je sa agregacijom, jer se izvješćuje da određeni sojevi E. coli i Pseudomonas aeruginosa smanjuju svoju osjetljivost na nano-srebro ekspresijom proteina flagelina, flagelina.Ima visok afinitet prema srebru, čime izaziva agregaciju.20
Postoji nekoliko različitih mehanizama vezanih za toksičnost srebrnih nanočestica, a agregacija utiče na sve ove mehanizme.Metoda biološke aktivnosti AgNP-a o kojoj se najviše raspravlja, koja se ponekad naziva i mehanizam „trojanskog konja“, smatra AgNP nosiocima Ag+.1,21 Mehanizam trojanskog konja može osigurati veliko povećanje lokalne koncentracije Ag+, što dovodi do stvaranja ROS i depolarizacije membrane.22-24 Agregacija može uticati na oslobađanje Ag+, čime utiče na toksičnost, jer smanjuje efektivnu aktivnu površinu na kojoj se joni srebra mogu oksidirati i rastvoriti.Međutim, AgNP neće pokazati toksičnost samo kroz oslobađanje jona.Mnoge interakcije vezane za veličinu i morfologiju moraju se uzeti u obzir.Među njima, veličina i oblik površine nanočestica su ključne karakteristike.4,25 Zbirka ovih mehanizama može se kategorizirati kao “inducirani mehanizmi toksičnosti”.Postoji potencijalno mnogo reakcija mitohondrija i površinske membrane koje mogu oštetiti organele i uzrokovati smrt stanice.25-27 Budući da formiranje agregata prirodno utiče na veličinu i oblik objekata koji sadrže srebro koje prepoznaju živi sistemi, ove interakcije također mogu biti pogođene.
U našem prethodnom radu o agregaciji nanočestica srebra, demonstrirali smo efikasan postupak skrininga koji se sastoji od hemijskih i in vitro bioloških eksperimenata za proučavanje ovog problema.19 Dynamic Light Scattering (DLS) je poželjna tehnika za ove vrste inspekcija jer materijal može raspršiti fotone na talasnoj dužini koja je uporediva sa veličinom njegovih čestica.Budući da je Brownova brzina kretanja čestica u tečnom mediju povezana s veličinom, promjena intenziteta raspršene svjetlosti može se koristiti za određivanje prosječnog hidrodinamičkog promjera (Z-srednja) tekućeg uzorka.28 Osim toga, primjenom napona na uzorak, zeta potencijal (ζ potencijal) nanočestice može se izmjeriti slično Z prosječnoj vrijednosti.13,28 Ako je apsolutna vrijednost zeta potencijala dovoljno visoka (prema općim smjernicama > ±30 mV), to će stvoriti snažno elektrostatičko odbijanje između čestica kako bi se suprotstavilo agregaciji.Karakteristična površinska plazmonska rezonanca (SPR) je jedinstven optički fenomen, koji se uglavnom pripisuje nanočesticama plemenitih metala (uglavnom Au i Ag).29​​ Na osnovu elektronskih oscilacija (površinskih plazmona) ovih materijala na nanoskali, poznato je da sferni AgNP imaju karakterističan UV-Vis apsorpcioni vrh blizu 400 nm.30 Intenzitet i pomak talasne dužine čestica se koriste za dopunu DLS rezultata, jer se ova metoda može koristiti za detekciju agregacije nanočestica i površinske adsorpcije biomolekula.
Na osnovu dobijenih informacija, testovi vitalnosti ćelija (MTT) i antibakterijski testovi se izvode na način na koji se toksičnost AgNP opisuje kao funkcija nivoa agregacije, a ne (najčešće korišćeni faktor) koncentracije nanočestica.Ova jedinstvena metoda nam omogućava da demonstriramo duboku važnost nivoa agregacije u biološkoj aktivnosti, jer, na primjer, citratno-terminirani AgNP-ovi potpuno gube svoju biološku aktivnost u roku od nekoliko sati zbog agregacije.19
U sadašnjem radu, cilj nam je da uvelike proširimo naše prethodne doprinose stabilnosti bio-srodnih koloida i njihovog uticaja na biološku aktivnost proučavanjem uticaja veličine nanočestica na agregaciju nanočestica.Ovo je nesumnjivo jedna od studija o nanočesticama.Perspektiva višeg profila i 31 Da bi se istražilo ovo pitanje, korištena je metoda rasta posredovana sjemenom za proizvodnju AgNP-ova s ​​citratom u tri različita raspona veličina (10, 20 i 50 nm).6,32 kao jedna od najčešćih metoda.Za nanomaterijale koji se široko i rutinski koriste u medicinskim aplikacijama, odabrani su AgNP-ovi s citratom različitih veličina kako bi se proučavala moguća ovisnost o veličini bioloških svojstava nanosrebra povezanih s agregacijom.Nakon sinteze AgNP-a različitih veličina, proizvedene uzorke smo karakterizirali transmisijskom elektronskom mikroskopijom (TEM), a zatim ispitali čestice primjenom gore navedene procedure skrininga.Osim toga, u prisutnosti in vitro ćelijskih kultura Dulbecco-ovog modificiranog orlovog medijuma (DMEM) i fetalnog goveđeg seruma (FBS), agregacijsko ponašanje ovisno o veličini i njegovo ponašanje procijenjeno je pri različitim pH vrijednostima, koncentracijama NaCl, glukoze i glutamina.Karakteristike citotoksičnosti određuju se pod sveobuhvatnim uslovima.Naučni konsenzus ukazuje da su generalno manje čestice poželjnije;naše istraživanje pruža hemijsku i biološku platformu za utvrđivanje da li je to slučaj.
Tri nanočestice srebra s različitim rasponima veličina pripremljene su metodom rasta posredovanom sjemenom koju su predložili Wan et al., uz mala podešavanja.6 Ova metoda se zasniva na hemijskoj redukciji, koristeći srebrni nitrat (AgNO3) kao izvor srebra, natrijum borohidrid (NaBH4) kao redukciono sredstvo i natrijum citrat kao stabilizator.Prvo pripremite 75 mL 9 mM vodenog rastvora citrata iz natrijum citrat dihidrata (Na3C6H5O7 x 2H2O) i zagrejte na 70°C.Zatim je u reakcionu sredinu dodato 2 mL 1% w/v rastvora AgNO3, a zatim je u smešu kap po kap uliven sveže pripremljen rastvor natrijum borhidrida (2 mL 0,1% w/v).Rezultirajuća žuto-smeđa suspenzija je držana na 70°C uz snažno miješanje 1 sat, a zatim ohlađena na sobnu temperaturu.Dobijeni uzorak (koji se od sada naziva AgNP-I) koristi se kao osnova za rast posredovan sjemenom u sljedećem koraku sinteze.
Da biste sintetizirali suspenziju čestica srednje veličine (označena kao AgNP-II), zagrijte 90 mL 7,6 mM otopine citrata na 80°C, pomiješajte je sa 10 mL AgNP-I, a zatim pomiješajte 2 mL 1% w/v otopine AgNO3 je držan uz snažno mehaničko miješanje 1 sat, a zatim je uzorak ohlađen na sobnu temperaturu.
Za najveću česticu (AgNP-III), ponovite isti proces rasta, ali u ovom slučaju koristite 10 mL AgNP-II kao suspenziju sjemena.Nakon što uzorci dostignu sobnu temperaturu, postavljaju svoju nominalnu koncentraciju Ag baziranu na ukupnom sadržaju AgNO3 na 150 ppm dodavanjem ili isparavanjem dodatnog otapala na 40°C i na kraju ih čuvaju na 4°C do daljnje upotrebe.
Koristite FEI Tecnai G2 20 X-Twin transmisioni elektronski mikroskop (TEM) (FEI korporativno sjedište, Hillsboro, Oregon, SAD) sa naponom ubrzanja od 200 kV da biste ispitali morfološke karakteristike nanočestica i uhvatili njihov obrazac difrakcije elektrona (ED).Najmanje 15 reprezentativnih slika (~750 čestica) je procijenjeno pomoću softverskog paketa ImageJ, a rezultirajući histogrami (i svi grafikoni u cijeloj studiji) kreirani su u OriginPro 2018 (OriginLab, Northampton, MA, USA) 33, 34.
Prosječni hidrodinamički promjer (Z-prosjek), zeta potencijal (ζ-potencijal) i karakteristična površinska plazmonska rezonanca (SPR) uzoraka su izmjereni kako bi se ilustrovala njihova početna koloidna svojstva.Prosječni hidrodinamički promjer i zeta potencijal uzorka mjereni su Malvern Zetasizer Nano ZS instrumentom (Malvern Instruments, Malvern, UK) korištenjem presavijenih kapilarnih ćelija za jednokratnu upotrebu na 37±0,1°C.Ocean Optics 355 DH-2000-BAL UV-Vis spektrofotometar (Halma PLC, Largo, FL, SAD) korišćen je za dobijanje karakterističnih SPR karakteristika iz UV-Vis apsorpcionih spektra uzoraka u opsegu od 250-800 nm.
Tokom cijelog eksperimenta istovremeno su vršena tri različita tipa mjerenja vezanih za koloidnu stabilnost.Koristite DLS za mjerenje prosječnog hidrodinamičkog promjera (Z prosjek) i zeta potencijala (ζ potencijal) čestica, jer je Z prosjek povezan s prosječnom veličinom agregata nanočestica, a zeta potencijal pokazuje da li je elektrostatičko odbijanje u sistemu je dovoljno jak da nadoknadi Van der Waalsovu privlačnost između nanočestica.Mjerenja se vrše u tri primjerka, a standardna devijacija Z srednje vrijednosti i zeta potencijala se izračunava softverom Zetasizer.Karakteristični SPR spektri čestica se procjenjuju UV-Vis spektroskopijom, jer promjene u vršnom intenzitetu i talasnoj dužini mogu ukazivati ​​na agregaciju i površinske interakcije.29,35 Zapravo, površinska plazmonska rezonanca u plemenitim metalima je toliko utjecajna da je dovela do novih metoda analize biomolekula.29,36,37 Koncentracija AgNP-a u eksperimentalnoj smjesi je oko 10 ppm, a svrha je da se intenzitet maksimalne početne apsorpcije SPR-a postavi na 1. Eksperiment je izveden vremenski ovisan na 0;1.5;3;6;12 i 24 sata pod različitim biološki relevantnim uslovima.Više detalja koji opisuju eksperiment možete vidjeti u našem prethodnom radu.19 Ukratko, različite pH vrijednosti (3; 5; 7,2 i 9), različite koncentracije natrijevog klorida (10 mM; 50 mM; 150 mM), glukoze (3,9 mM; 6,7 mM) i glutamina (4 mM) i takođe je pripremio Dulbecco-ov modifikovani orlov medijum (DMEM) i fetalni goveđi serum (FBS) (u vodi i DMEM) kao modelne sisteme i proučavao njihove efekte na ponašanje agregacije sintetizovanih nanočestica srebra.pH Vrijednosti NaCl, glukoze i glutamina procjenjuju se na osnovu fizioloških koncentracija, dok su količine DMEM i FBS iste kao i razine korištene u cijelom in vitro eksperimentu.38-42 Sva mjerenja su izvedena na pH 7,2 i 37°C sa konstantnom pozadinskom koncentracijom soli od 10 mM NaCl kako bi se eliminisale bilo kakve interakcije čestica na velikim udaljenostima (osim određenih eksperimenata vezanih za pH i NaCl, gdje su ovi atributi varijable pod studija).28 Lista različitih stanja je sažeta u Tabeli 1. Eksperiment označen sa † koristi se kao referenca i odgovara uzorku koji sadrži 10 mM NaCl i pH 7,2.
Ćelijska linija raka prostate (DU145) i besmrtni humani keratinociti (HaCaT) dobijeni su od ATCC (Manassas, VA, SAD).Ćelije se rutinski uzgajaju u Dulbeccovom minimalnom esencijalnom mediju Eagle (DMEM) koji sadrži 4,5 g/L glukoze (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, SAD), dopunjen sa 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 0,01% streptomicina i 0,005% Penicilin (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, SAD).Ćelije se uzgajaju u inkubatoru na 37°C pod 5% CO2 i 95% vlažnosti.
Kako bi se istražile promjene u citotoksičnosti AgNP uzrokovane agregacijom čestica na način ovisan o vremenu, izveden je MTT test u dva koraka.Prvo, izmjerena je održivost dva tipa ćelija nakon tretmana sa AgNP-I, AgNP-II i AgNP-III.U tu svrhu, dvije vrste ćelija su posađene u ploče sa 96 jažica pri gustini od 10.000 ćelija/jažici i tretirane sa tri različite veličine nanočestica srebra u rastućim koncentracijama drugog dana.Nakon 24 sata tretmana, ćelije su isprane PBS-om i inkubirane sa 0,5 mg/mL MTT reagensa (SERVA, Heidelberg, Njemačka) razrijeđenim u mediju kulture 1 sat na 37°C.Kristali formazana su rastvoreni u DMSO (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, SAD), a apsorpcija je izmerena na 570 nm pomoću čitača ploča Synergy HTX (BioTek-Mađarska, Budimpešta, Mađarska).Vrijednost apsorpcije netretiranog kontrolnog uzorka smatra se stopom preživljavanja od 100%.Izvedite najmanje 3 eksperimenta koristeći četiri nezavisne biološke replike.IC50 se izračunava iz krive odgovora na dozu na osnovu rezultata vitalnosti.
Nakon toga, u drugom koraku, inkubacijom čestica sa 150 mM NaCl u različitim vremenskim periodima (0, 1,5, 3, 6, 12 i 24 sata) prije tretmana ćelija, proizvedena su različita stanja agregacije nanočestica srebra.Nakon toga, izveden je isti MTT test kao što je prethodno opisano kako bi se procijenile promjene u vitalnosti ćelija na koje utiče agregacija čestica.Koristite GraphPad Prism 7 za procjenu konačnog rezultata, izračunajte statističku značajnost eksperimenta neparnim t-testom i označite njegov nivo kao * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01), *** (p ≤ 0,001 ) I **** (p ≤ 0,0001).
Tri različite veličine nanočestica srebra (AgNP-I, AgNP-II i AgNP-III) korištene su za antibakterijsku osjetljivost na Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM; Istraživački centar za patogene gljive i mikrobnu toksikologiju, Univerzitet Chiba) i Bacillus S1ZMC Test mega60 (SZMC: Szeged Microbiology Collection) i E. coli SZMC 0582 u mediju RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Co.).Da bi se procijenile promjene u antibakterijskoj aktivnosti uzrokovane agregacijom čestica, prvo je određena njihova minimalna inhibitorna koncentracija (MIC) mikrodilucijom u mikrotitarskoj ploči sa 96 jažica.U 50 μL standardizirane stanične suspenzije (5 × 104 ćelija/mL u mediju RPMI 1640) dodajte 50 μL suspenzije nanočestica srebra i serijski razrijedite dvostruku koncentraciju (u gore navedenom mediju raspon je 0 i 75 ppm, tj. kontrolni uzorak sadrži 50 μL ćelijske suspenzije i 50 μL podloge bez nanočestica).Nakon toga, ploča je inkubirana na 30°C 48 sati, a optička gustina kulture je izmjerena na 620 nm pomoću čitača SPECTROstar Nano ploča (BMG LabTech, Offenburg, Njemačka).Eksperiment je izveden tri puta u tri primjerka.
Osim što je u ovom trenutku korišćeno 50 μL pojedinačnih agregiranih uzoraka nanočestica, isti postupak kao što je prethodno opisan korišćen je da se ispita efekat agregacije na antibakterijsku aktivnost na prethodno pomenute sojeve.Različita stanja agregacije nanočestica srebra se proizvode inkubacijom čestica sa 150 mM NaCl u različitim vremenskim periodima (0, 1,5, 3, 6, 12 i 24 sata) prije obrade ćelije.Kao kontrola rasta korišćena je suspenzija sa dodatkom 50 μL medijuma RPMI 1640, dok je za kontrolu toksičnosti korišćena suspenzija sa neagregiranim nanočesticama.Eksperiment je izveden tri puta u tri primjerka.Koristite GraphPad Prism 7 da ponovo procenite konačni rezultat, koristeći istu statističku analizu kao i MTT analiza.
Karakteriziran je nivo agregacije najmanjih čestica (AgNP-I), a rezultati su djelimično objavljeni u našem prethodnom radu, ali su za bolje poređenje sve čestice detaljno pregledane.Eksperimentalni podaci se prikupljaju i raspravljaju u sljedećim odjeljcima.Tri veličine AgNP.19
Mjerenja koja su izvršili TEM, UV-Vis i DLS potvrdila su uspješnu sintezu svih uzoraka AgNP (Slika 2A-D).Prema prvom redu slike 2, najmanja čestica (AgNP-I) pokazuje jednoliku sfernu morfologiju sa prosječnim prečnikom od oko 10 nm.Metoda rasta posredovana sjemenom također pruža AgNP-II i AgNP-III različite veličine veličine sa prosječnim prečnikom čestica od približno 20 nm i 50 nm, respektivno.Prema standardnoj devijaciji distribucije čestica, veličine tri uzorka se ne preklapaju, što je važno za njihovu komparativnu analizu.Poređenjem prosječnog omjera širine i visine 2D projekcija čestica zasnovanih na TEM-u, pretpostavlja se da se sferičnost čestica procjenjuje pomoću dodatka za filter oblika ImageJ (Slika 2E).43 Prema analizi oblika čestica, na njihov omjer (velika strana/kratka strana najmanjeg graničnog pravokutnika) ne utječe rast čestica, a njihov omjer tankosti (izmjerena površina odgovarajućeg savršenog kruga/teorijske površine ) postepeno se smanjuje.Ovo rezultira sve više i više poliedarskih čestica, koje su u teoriji savršeno okrugle, što odgovara omjeru tankosti od 1.
Slika 2 Slika 2 transmisionog elektronskog mikroskopa (TEM), uzorak elektronske difrakcije (ED) (B), histogram distribucije veličine (C), karakterističan spektar apsorpcije ultraljubičastog (UV-Vis) svjetlosti (D) i prosječna tekućina citrata -završene nanočestice srebra sa mehaničkim prečnikom (Z-prosjek), zeta potencijalom, omjerom širine i debljine (E) imaju tri različita raspona veličina: AgNP-I je 10 nm (gornji red), AgNP -II je 20 nm (srednji red) ), AgNP-III (donji red) je 50 nm.
Iako je ciklička priroda metode rasta utjecala na oblik čestice u određenoj mjeri, što je rezultiralo manjom sferičnosti većih AgNP-ova, sva tri uzorka su ostala kvazi-sferična.Osim toga, kao što je prikazano na dijagramu difrakcije elektrona na slici 2B, nano kristalnost čestica nije pogođena.Istaknuti difrakcioni prsten – koji se može povezati sa (111), (220), (200) i (311) Millerovim indeksima srebra – vrlo je u skladu sa naučnom literaturom i našim prethodnim doprinosima.9, 19,44 Fragmentacija Debye-Scherrerovog prstena AgNP-II i AgNP-III nastaje zbog činjenice da je ED slika snimljena pri istom povećanju, tako da kako se veličina čestica povećava, broj difrakiranih čestica po jedinica površine se povećava i smanjuje.
Poznato je da veličina i oblik nanočestica utiču na biološku aktivnost.3,45 Katalitička i biološka aktivnost zavisna od oblika može se objasniti činjenicom da različiti oblici imaju tendenciju proliferacije određenih kristalnih površina (koji imaju različite Millerove indekse), a ove kristalne površine imaju različite aktivnosti.45,46 Budući da pripremljene čestice daju slične ED rezultate koji odgovaraju vrlo sličnim kristalnim karakteristikama, može se pretpostaviti da u našim kasnijim eksperimentima koloidne stabilnosti i biološke aktivnosti sve uočene razlike treba pripisati veličini nanočestica, a ne svojstvima vezanim za oblik.
UV-Vis rezultati sažeti na slici 2D dodatno naglašavaju ogromnu sferičnu prirodu sintetiziranog AgNP, jer su SPR pikovi sva tri uzorka oko 400 nm, što je karakteristična vrijednost sfernih nanočestica srebra.29,30 Uhvaćeni spektri su također potvrdili uspješan rast nanosrebra posredovan sjemenom.Kako se veličina čestica povećava, talasna dužina koja odgovara maksimalnoj apsorpciji svetlosti AgNP-II-izraženija-Prema literaturi, AgNP-III je doživeo crveni pomak.6,29
Što se tiče početne koloidne stabilnosti AgNP sistema, DLS je korišten za mjerenje prosječnog hidrodinamičkog prečnika i zeta potencijala čestica pri pH 7,2.Rezultati prikazani na slici 2E pokazuju da AgNP-III ima veću koloidnu stabilnost od AgNP-I ili AgNP-II, jer uobičajene smjernice ukazuju da je zeta potencijal od 30 mV apsolutnih neophodan za dugoročnu koloidnu stabilnost. Ovaj nalaz je dodatno podržan kada Z prosječna vrijednost (dobijena kao prosječni hidrodinamički promjer slobodnih i agregiranih čestica) se upoređuje sa primarnom veličinom čestica dobijenom TEM, jer što su dvije vrijednosti bliže, to je blaži stepen Gather u uzorku.Zapravo, Z prosjek AgNP-I i AgNP-II je razumno veći od njihove glavne veličine čestica procijenjene TEM, tako da se u poređenju sa AgNP-III predviđa da će ovi uzorci imati veću vjerovatnoću da će se agregirati, gdje je visoko negativan zeta potencijal prati bliska veličina Z prosječna vrijednost.
Objašnjenje za ovaj fenomen može biti dvostruko.S jedne strane, koncentracija citrata se održava na sličnom nivou u svim koracima sinteze, osiguravajući relativno visoku količinu nabijenih površinskih grupa kako bi se spriječilo smanjenje specifične površine čestica koje rastu.Međutim, prema Levaku et al., male molekule poput citrata mogu se lako zamijeniti biomolekulama na površini nanočestica.U ovom slučaju, koloidna stabilnost će biti određena koronom proizvedenih biomolekula.31 Budući da je ovo ponašanje uočeno i u našim mjerenjima agregacije (o čemu ćemo detaljnije govoriti kasnije), samo ograničenje citrata ne može objasniti ovaj fenomen.
S druge strane, veličina čestica je obrnuto proporcionalna tendenciji agregacije na nanometarskom nivou.Ovo je uglavnom podržano tradicionalnom metodom Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO), gdje se privlačenje čestica opisuje kao zbir privlačnih i odbojnih sila između čestica.Prema He i saradnicima, maksimalna vrijednost DLVO energetske krive se smanjuje s veličinom nanočestica u nanočesticama hematita, što olakšava postizanje minimalne primarne energije, čime se potiče nepovratna agregacija (kondenzacija).47 Međutim, spekuliše se da postoje i drugi aspekti izvan ograničenja DLVO teorije.Iako su van der Waalsova gravitacija i elektrostatičko dvoslojno odbijanje slični s povećanjem veličine čestica, pregled Hotze et al.predlaže da ima jači učinak na agregaciju nego što DLVO dozvoljava.14 Oni vjeruju da se površinska zakrivljenost nanočestica više ne može procjenjivati ​​kao ravna površina, što matematičku procjenu čini neprimjenjivom.Osim toga, kako se veličina čestica smanjuje, postotak atoma prisutnih na površini postaje veći, što dovodi do elektronske strukture i ponašanja površinskog naboja.I površinska reaktivnost se mijenja, što može dovesti do smanjenja naboja u električnom dvostrukom sloju i potaknuti agregaciju.
Upoređujući DLS rezultate za AgNP-I, AgNP-II i AgNP-III na slici 3, uočili smo da su sva tri uzorka pokazala sličnu agregaciju pH koja potiče.Jako kisela sredina (pH 3) pomjera zeta potencijal uzorka na 0 mV, uzrokujući da čestice formiraju agregate mikronske veličine, dok alkalni pH pomjera svoj zeta potencijal na veću negativnu vrijednost, gdje čestice formiraju manje agregate (pH 5 ).I 7.2) ), ili ostaju potpuno neagregirani (pH 9).Uočene su i neke važne razlike između različitih uzoraka.Tokom eksperimenta, AgNP-I se pokazao najosjetljivijim na promjene zeta potencijala izazvane pH, jer je zeta potencijal ovih čestica smanjen na pH 7,2 u odnosu na pH 9, dok su AgNP-II i AgNP-III pokazali samo A značajna promjena ζ je oko pH 3. Osim toga, AgNP-II je pokazao sporije promjene i umjereni zeta potencijal, dok je AgNP-III pokazao najblaže ponašanje od tri, jer je sistem pokazao najveću apsolutnu zeta vrijednost i sporo kretanje trenda, što ukazuje na AgNP-III Najotporniji na pH-indukovanu agregaciju.Ovi rezultati su u skladu s rezultatima mjerenja prosječnog hidrodinamičkog promjera.Uzimajući u obzir veličinu čestica njihovih prajmera, AgNP-I je pokazao konstantnu postepenu agregaciju pri svim pH vrednostima, najverovatnije zbog 10 mM pozadine NaCl, dok su AgNP-II i AgNP-III pokazali značajnu samo pri pH 3 sakupljanja.Najzanimljivija razlika je u tome što uprkos velikoj veličini nanočestica, AgNP-III formira najmanje agregate pri pH 3 za 24 sata, naglašavajući njegova svojstva protiv agregacije.Dijeljenjem prosječnog Z AgNP-a pri pH 3 nakon 24 sata sa vrijednošću pripremljenog uzorka, može se primijetiti da su se relativne veličine agregata AgNP-I i AgNP-II povećale za 50 puta, 42 puta i 22 puta , odnosno.III.
Slika 3. Rezultati dinamičkog raspršivanja svjetlosti uzorka nanočestica srebra završenih citratom sa povećanjem veličine (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II i 50 nm: AgNP-III) izraženi su kao prosječni hidrodinamički promjer (Z prosjek ) (desno) Pod različitim pH uslovima, zeta potencijal (levo) se menja u roku od 24 sata.
Uočena pH-zavisna agregacija također je utjecala na karakterističnu površinsku plazmonsku rezonancu (SPR) uzoraka AgNP, o čemu svjedoče njihovi UV-Vis spektri.Prema Dodatnoj slici S1, agregacija sve tri suspenzije nanočestica srebra praćena je smanjenjem intenziteta njihovih SPR vrhova i umjerenim crvenim pomakom.Stepen ovih promjena u funkciji pH je u skladu sa stepenom agregacije predviđenim DLS rezultatima, međutim, uočeni su neki zanimljivi trendovi.Suprotno intuiciji, pokazalo se da je AgNP-II srednje veličine najosjetljiviji na SPR promjene, dok su druga dva uzorka manje osjetljiva.U SPR istraživanju, 50 nm je teorijska granica veličine čestica, koja se koristi za razlikovanje čestica na osnovu njihovih dielektričnih svojstava.Čestice manje od 50 nm (AgNP-I i AgNP-II) mogu se opisati kao jednostavni dielektrični dipoli, dok čestice koje dostižu ili prelaze ovu granicu (AgNP-III) imaju složenije dielektrične osobine, a njihova rezonancija traka se dijeli na multimodalne promjene .U slučaju dva manja uzorka čestica, AgNP se mogu smatrati jednostavnim dipolima, a plazma se lako može preklapati.Kako se veličina čestica povećava, ovo spajanje u suštini proizvodi veću plazmu, što može objasniti veću uočenu osjetljivost.29 Međutim, za najveće čestice, jednostavna dipolna procjena nije važeća kada se mogu pojaviti i druga stanja spajanja, što može objasniti smanjenu tendenciju AgNP-III da ukazuje na spektralne promjene.29
U našim eksperimentalnim uvjetima dokazano je da pH vrijednost ima snažan utjecaj na koloidnu stabilnost nanočestica srebra obloženih citratom različitih veličina.U ovim sistemima, stabilnost je obezbeđena negativno naelektrisanim -COO- grupama na površini AgNP.Karboksilatna funkcionalna grupa citratnog jona protonirana je u velikom broju H+ jona, tako da generirana karboksilna grupa više ne može osigurati elektrostatičko odbijanje između čestica, kao što je prikazano u gornjem redu slike 4. Prema Le Chatelierovom principu, AgNP uzorci se brzo agregiraju na pH 3, ali postepeno postaju sve stabilniji kako se pH povećava.
Slika 4 Šematski mehanizam površinske interakcije definiran agregacijom pod različitim pH (gornji red), koncentracijom NaCl (srednji red) i biomolekulama (donji red).
Prema slici 5, koloidna stabilnost u suspenzijama AgNP različitih veličina također je ispitivana pod povećanjem koncentracije soli.Zasnovano na zeta potencijalu, povećana veličina nanočestica u ovim AgNP sistemima sa citratom završava opet pruža povećanu otpornost na vanjske utjecaje iz NaCl.U AgNP-I, 10 mM NaCl je dovoljno da izazove blagu agregaciju, a koncentracija soli od 50 mM daje vrlo slične rezultate.U AgNP-II i AgNP-III, 10 mM NaCl ne utiče značajno na zeta potencijal jer njihove vrijednosti ostaju na (AgNP-II) ili ispod (AgNP-III) -30 mV.Povećanje koncentracije NaCl na 50 mM i konačno na 150 mM NaCl je dovoljno da se značajno smanji apsolutna vrijednost zeta potencijala u svim uzorcima, iako veće čestice zadržavaju više negativnog naboja.Ovi rezultati su u skladu sa očekivanim prosječnim hidrodinamičkim promjerom AgNP-a;Z prosječne linije trenda mjerene na 10, 50 i 150 mM NaCl pokazuju različite, postepeno rastuće vrijednosti.Konačno, agregati mikronske veličine otkriveni su u sva tri eksperimenta od 150 mM.
Slika 5. Rezultati dinamičkog raspršenja svjetlosti uzorka nanočestica srebra završenih citratom sa povećanjem veličine (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II i 50 nm: AgNP-III) izraženi su kao prosječni hidrodinamički promjer (Z prosjek ) (desno) i zeta potencijal (lijevo) se mijenjaju unutar 24 sata pod različitim koncentracijama NaCl.
Rezultati UV-Vis na Dodatnoj slici S2 pokazuju da SPR od 50 i 150 mM NaCl u sva tri uzorka ima trenutno i značajno smanjenje.Ovo se može objasniti DLS-om, jer se agregacija na bazi NaCl događa brže od eksperimenata zavisnih od pH, što se objašnjava velikom razlikom između ranih (0, 1,5 i 3 sata) mjerenja.Osim toga, povećanje koncentracije soli će također povećati relativnu permitivnost eksperimentalnog medija, što će imati dubok utjecaj na površinsku plazmonsku rezonancu.29
Učinak NaCl je sažet u srednjem redu na slici 4. Generalno, može se zaključiti da povećanje koncentracije natrijum hlorida ima sličan učinak kao povećanje kiselosti, jer ioni Na+ imaju tendenciju koordinacije oko karboksilatnih grupa, suzbijanje negativnih zeta potencijalnih AgNPs.Osim toga, 150 mM NaCl proizvelo je agregate mikronske veličine u sva tri uzorka, što ukazuje da je fiziološka koncentracija elektrolita štetna za koloidnu stabilnost AgNP-a sa citratom.Uzimajući u obzir kritičnu koncentraciju kondenzacije (CCC) NaCl na sličnim AgNP sistemima, ovi rezultati se mogu pametno staviti u relevantnu literaturu.Huynh et al.izračunali su da je CCC NaCl za nanočestice srebra sa završetkom citratom prosječnog prečnika 71 nm 47,6 mM, dok je El Badawy et al.primijetio da je CCC 10 nm AgNP sa citratnom prevlakom 70 mM.10,16 Osim toga, He i saradnici su izmjerili značajno visok CCC od oko 300 mM, što je dovelo do toga da se njihova metoda sinteze razlikuje od prethodno spomenute publikacije.48 Iako trenutni doprinos nije usmjeren na sveobuhvatnu analizu ovih vrijednosti, jer se naši eksperimentalni uvjeti povećavaju kompleksnošću cjelokupne studije, čini se da je biološki relevantna koncentracija NaCl od 50 mM, posebno 150 mM NaCl, prilično visoka.Indukovana koagulacija, objašnjavajući uočene jake promjene.
Sljedeći korak u eksperimentu polimerizacije je korištenje jednostavnih, ali biološki relevantnih molekula za simulaciju interakcija nanočestica-biomolekula.Na osnovu DLS (slike 6 i 7) i UV-Vis rezultata (dodatne slike S3 i S4), mogu se izneti neki opšti zaključci.U našim eksperimentalnim uslovima, proučavani molekuli glukoze i glutamina neće izazvati agregaciju ni u jednom sistemu AgNP, jer je Z-srednji trend usko povezan sa odgovarajućom referentnom mernom vrednošću.Iako njihovo prisustvo ne utiče na agregaciju, eksperimentalni rezultati pokazuju da su ovi molekuli delimično adsorbovani na površini AgNP.Najistaknutiji rezultat koji podržava ovaj stav je uočena promjena u apsorpciji svjetlosti.Iako AgNP-I ne pokazuje značajne promjene talasne dužine ili intenziteta, može se jasnije uočiti mjerenjem većih čestica, što je najvjerovatnije zbog veće optičke osjetljivosti spomenute ranije.Bez obzira na koncentraciju, glukoza može izazvati veći crveni pomak nakon 1,5 sata u odnosu na kontrolno mjerenje, što je oko 40 nm u AgNP-II i oko 10 nm u AgNP-III, što dokazuje pojavu površinskih interakcija.Glutamin je pokazao sličan trend, ali promjena nije bila tako očigledna.Osim toga, također je vrijedno spomenuti da glutamin može smanjiti apsolutni zeta potencijal srednjih i velikih čestica.Međutim, budući da ove zeta promjene ne utječu na nivo agregacije, može se spekulirati da čak i male biomolekule poput glutamina mogu obezbijediti određeni stepen prostornog odbijanja između čestica.
Slika 6. Rezultati dinamičkog raspršenja svjetlosti uzoraka nanočestica srebra sa citratom-završetkom rastuće veličine (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II i 50 nm: AgNP-III) izraženi su kao prosječni hidrodinamički promjer (Z prosjek) (desno) Pod vanjskim uvjetima različitih koncentracija glukoze, zeta potencijal (lijevo) se mijenja u roku od 24 sata.
Slika 7. Rezultati dinamičkog raspršenja svjetlosti uzorka nanočestica srebra završenih citratom sa povećanjem veličine (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II i 50 nm: AgNP-III) izraženi su kao prosječni hidrodinamički promjer (Z prosjek ) (desno) U prisustvu glutamina, zeta potencijal (lijevo) se mijenja u roku od 24 sata.
Ukratko, male biomolekule poput glukoze i glutamina ne utječu na koloidnu stabilnost pri izmjerenoj koncentraciji: iako utiču na zeta potencijal i UV-Vis rezultate u različitom stupnju, rezultati Z prosjeka nisu konzistentni.Ovo ukazuje da površinska adsorpcija molekula inhibira elektrostatičko odbijanje, ali u isto vrijeme osigurava dimenzijsku stabilnost.
Kako bismo povezali prethodne rezultate sa prethodnim i što vještije simulirali biološke uvjete, odabrali smo neke od najčešće korištenih komponenti ćelijske kulture i iskoristili ih kao eksperimentalne uslove za proučavanje stabilnosti koloida AgNP.U cijelom in vitro eksperimentu, jedna od najvažnijih funkcija DMEM-a kao medija je uspostavljanje potrebnih osmotskih uvjeta, ali s kemijskog gledišta, riječ je o složenom rastvoru soli ukupne jonske snage slične 150 mM NaCl. .40 Što se tiče FBS-a, to je složena mješavina biomolekula-uglavnom proteina-sa stanovišta površinske adsorpcije, ima neke sličnosti sa eksperimentalnim rezultatima glukoze i glutamina, uprkos hemijskom sastavu i raznolikosti Pol je mnogo komplikovaniji.19 DLS i UV-Vidljivi rezultati prikazani na slici 8 i dodatnoj slici S5, respektivno, mogu se objasniti ispitivanjem hemijskog sastava ovih materijala i njihovom korelacijom sa merenjima u prethodnom odeljku.
Slika 8. Rezultati dinamičkog raspršenja svjetlosti uzorka nanočestica srebra završenih citratom sa povećanjem veličine (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II i 50 nm: AgNP-III) izraženi su kao prosječni hidrodinamički promjer (Z prosjek ) (desno) U prisustvu komponenti ćelijske kulture DMEM i FBS, zeta potencijal (lijevo) se mijenja u roku od 24 sata.
Razrjeđivanje AgNP-a različitih veličina u DMEM-u ima sličan učinak na koloidnu stabilnost kao onaj koji se opaža u prisustvu visokih koncentracija NaCl.Disperzija AgNP u 50 v/v% DMEM pokazala je da je agregacija velikih razmjera otkrivena sa povećanjem zeta potencijala i Z-prosječne vrijednosti i naglim smanjenjem SPR intenziteta.Vrijedi napomenuti da je maksimalna veličina agregata izazvana DMEM-om nakon 24 sata obrnuto proporcionalna veličini nanočestica prajmera.
Interakcija između FBS i AgNP je slična onoj uočenoj u prisustvu manjih molekula kao što su glukoza i glutamin, ali je učinak jači.Z prosek čestica ostaje nepromenjen, dok se detektuje povećanje zeta potencijala.SPR pik je pokazao blagi crveni pomak, ali što je možda još zanimljivije, intenzitet SPR-a se nije smanjio toliko značajno kao u kontrolnom mjerenju.Ovi rezultati se mogu objasniti urođenom adsorpcijom makromolekula na površini nanočestica (donji red na slici 4), što se sada shvata kao formiranje biomolekularne korone u telu.49