Srebrne nanočestice (AgNP) smatraju se potencijalno korisnim alatom za kontrolu različitih patogena.Međutim, postoji zabrinutost oko oslobađanja AgNP-a u okolišne medije, jer mogu izazvati štetne posljedice po ljudsko zdravlje i okoliš.U ovoj studiji razvili smo i procijenili novi magnetni hibridni koloid mikrometarske veličine (MHC) ukrašen AgNPs različitih veličina (AgNP-MHCs).Nakon primjene za dezinfekciju, ove čestice se mogu lako izvući iz okoline koristeći svoja magnetna svojstva i ostaju učinkovite za inaktivaciju virusnih patogena.Procijenili smo efikasnost AgNP-MHC za inaktivaciju bakteriofaga ϕX174, mišjeg norovirusa (MNV) i adenovirusa serotipa 2 (AdV2).Ovi ciljni virusi su bili izloženi AgNP-MHCs tokom 1, 3 i 6 h na 25°C, a zatim analizirani testom plaka i TaqMan PCR u realnom vremenu.AgNP-MHCs su bili izloženi širokom rasponu pH nivoa i vode iz slavine i površinske vode kako bi se procenili njihovi antivirusni efekti u različitim uslovima okoline.Među tri testirana tipa AgNP-MHC, Ag30-MHCs su pokazali najveću efikasnost za inaktivaciju virusa.ϕX174 i MNV su smanjeni za više od 2 log10 nakon izlaganja 4,6 × 109 Ag30-MHCs/ml tokom 1 sata.Ovi rezultati su pokazali da se AgNP-MHC mogu koristiti za inaktivaciju virusnih patogena uz minimalnu mogućnost potencijalnog oslobađanja u okoliš.

Sa nedavnim napretkom u nanotehnologiji, nanočestice dobijaju sve veću pažnju širom sveta u oblastima biotehnologije, medicine i javnog zdravlja (1,2).Zbog svog visokog omjera površine i zapremine, materijali nano veličine, obično u rasponu od 10 do 500 nm, imaju jedinstvena fizičko-hemijska svojstva u usporedbi s onima većih materijala (1).Oblik i veličina nanomaterijala se mogu kontrolirati, a specifične funkcionalne grupe mogu se konjugirati na njihovim površinama kako bi se omogućile interakcije s određenim proteinima ili unutarćelijski unos (3,–5).

Srebrne nanočestice (AgNP) su široko proučavane kao antimikrobni agens (6).Srebro se koristi u izradi finog pribora za jelo, za ukrase i u terapijskim sredstvima.Jedinjenja srebra, kao što su srebrni sulfadiazin i određene soli, korišćena su kao proizvodi za njegu rana i kao tretmani zaraznih bolesti zbog svojih antimikrobnih svojstava (6,7).Nedavne studije su otkrile da su AgNPs vrlo učinkoviti za inaktivaciju različitih vrsta bakterija i virusa (8,–11).AgNP i Ag+ ioni koji se oslobađaju iz AgNP-a u direktnoj su interakciji s biomolekulama koje sadrže fosfor ili sumpor, uključujući DNK, RNK i proteine ​​(12,–14).Također se pokazalo da stvaraju reaktivne kisikove vrste (ROS), uzrokujući oštećenje membrane kod mikroorganizama (15).Veličina, oblik i koncentracija AgNP-a su također važni faktori koji utječu na njihove antimikrobne sposobnosti (8,10,13,16,17).

Prethodne studije su također istakle nekoliko problema kada se AgNP koriste za kontrolu patogena u vodenoj sredini.Prvo, postojeće studije o efikasnosti AgNP-a za inaktivaciju virusnih patogena u vodi su ograničene.Osim toga, monodisperzni AgNP su obično podložni agregaciji čestica-čestica zbog svoje male veličine i velike površine, a ovi agregati smanjuju efikasnost AgNP-a protiv mikrobnih patogena (7).Konačno, pokazalo se da AgNP imaju različite citotoksične efekte (5,18,–20), a oslobađanje AgNP-a u vodenu sredinu može rezultirati zdravstvenim i ekološkim problemima ljudi.

Nedavno smo razvili novi magnetni hibridni koloid mikrometarske veličine (MHC) ukrašen AgNP različitih veličina (21,22).MHC jezgro se može koristiti za oporavak AgNP kompozita iz okoline.Procijenili smo antivirusnu efikasnost ovih nanočestica srebra na MHC (AgNP-MHC) koristeći bakteriofag ϕX174, mišji norovirus (MNV) i adenovirus u različitim uvjetima okoline.

Antivirusni efekti AgNP-MHCs u različitim koncentracijama protiv bakteriofaga ϕX174 (a), MNV (b) i AdV2 (c).Ciljni virusi su tretirani različitim koncentracijama AgNP-MHCs, te OH-MHCs (4,6 × 109 čestica/ml) kao kontrola, u inkubatoru za mućkanje (150 rpm, 1 h, 25°C).Metoda analize plaka korištena je za mjerenje preživjelih virusa.Vrijednosti su srednje vrijednosti ± standardne devijacije (SD) iz tri nezavisna eksperimenta.Zvjezdice označavaju značajno različite vrijednosti (P< 0,05 jednosmjernom ANOVA-om sa Dunettovim testom).

Ova studija je pokazala da su AgNP-MHC efikasni za inaktivaciju bakteriofaga i MNV, surogata za humani norovirus, u vodi.Osim toga, AgNP-MHCs se mogu lako povratiti pomoću magneta, efikasno sprječavajući oslobađanje potencijalno toksičnih AgNP-a u okoliš.Brojne prethodne studije su pokazale da su koncentracija i veličina čestica AgNP-a kritični faktori za inaktivaciju ciljanog mikroorganizma (8,16,17).Antimikrobni efekti AgNP-a također zavise od vrste mikroorganizma.Efikasnost AgNP-MHCs za inaktivaciju ϕX174 pratila je odnos doza-odgovor.Među testiranim AgNP-MHCs, Ag30-MHC su imali veću efikasnost za inaktivaciju ϕX174 i MNV.Za MNV, samo Ag30-MHCs su pokazali antivirusnu aktivnost, dok ostali AgNP-MHCs nisu generirali nikakvu značajnu inaktivaciju MNV.Nijedan od AgNP-MHC nije imao nikakvu značajnu antivirusnu aktivnost protiv AdV2.

Osim veličine čestica, važna je i koncentracija srebra u AgNP-MHCs.Čini se da koncentracija srebra određuje efikasnost antivirusnih efekata AgNP-MHC.Koncentracije srebra u rastvorima Ag07-MHCs i Ag30-MHCs pri 4,6 × 109 čestica/ml bile su 28,75 ppm i 200 ppm, respektivno, i bile su u korelaciji sa nivoom antivirusne aktivnosti.Tabela 2sumira koncentracije srebra i površine testiranih AgNP-MHCs.Ag07-MHCs pokazao je najnižu antivirusnu aktivnost i imao najnižu koncentraciju srebra i površinu, što sugerira da su ova svojstva povezana s antivirusnom aktivnošću AgNP-MHC.

Naše prethodno istraživanje je pokazalo da su glavni antimikrobni mehanizmi AgNP-MHC hemijska apstrakcija Mg2+ ili Ca2+ jona iz mikrobnih membrana, stvaranje kompleksa sa tiolnim grupama koje se nalaze na membranama i stvaranje reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) (21).Budući da AgNP-MHC imaju relativno veliku veličinu čestica (∼500 nm), malo je vjerovatno da mogu prodrijeti kroz virusni kapsid.Umjesto toga, čini se da AgNP-MHC stupaju u interakciju s virusnim površinskim proteinima.AgNP-ovi na kompozitima imaju tendenciju da vežu biomolekule koje sadrže tiolnu grupu ugrađene u proteine ​​omotača virusa.Stoga su biohemijska svojstva virusnih kapsidnih proteina važna za određivanje njihove osjetljivosti na AgNP-MHCs.Slika 1pokazuje različitu osjetljivost virusa na efekte AgNP-MHCs.Bakteriofagi ϕX174 i MNV su bili osjetljivi na AgNP-MHCs, ali je AdV2 bio otporan.Visok nivo otpornosti AdV2 je verovatno povezan sa njegovom veličinom i strukturom.Adenovirusi su veličine od 70 do 100 nm (30), što ih čini mnogo većim od ϕX174 (27 do 33 nm) i MNV (28 do 35 nm) (31,32).Pored svoje velike veličine, adenovirusi imaju dvolančanu DNK, za razliku od drugih virusa, i otporni su na različite stresove iz okoline kao što su toplota i UV zračenje (33,34).Naša prethodna studija je objavila da se skoro 3-log10 smanjenje MS2 dogodilo sa Ag30-MHC u roku od 6 h (21).MS2 i ϕX174 imaju slične veličine sa različitim tipovima nukleinske kiseline (RNA ili DNK), ali imaju slične stope inaktivacije Ag30-MHC.Stoga se čini da priroda nukleinske kiseline nije glavni faktor rezistencije na AgNP-MHCs.Umjesto toga, činilo se da su veličina i oblik virusnih čestica važniji, jer je adenovirus mnogo veći virus.Ag30-MHC su postigli skoro 2-log10 smanjenje M13 u roku od 6 h (naši neobjavljeni podaci).M13 je jednolančani DNK virus (35) i ima ∼880 nm dužine i 6,6 nm u prečniku (36).Stopa inaktivacije filamentoznog bakteriofaga M13 bila je srednja između onih malih virusa okrugle strukture (MNV, ϕX174 i MS2) i velikog virusa (AdV2).

U ovoj studiji, kinetika inaktivacije MNV se značajno razlikovala u testu plaka i RT-PCR testu (Slika 2bi​andc).c).Poznato je da molekularni testovi kao što je RT-PCR značajno podcjenjuju stope inaktivacije virusa (25,28), kao što je utvrđeno u našoj studiji.Budući da AgNP-MHC prvenstveno stupaju u interakciju s površinom virusa, vjerojatnije je da će oštetiti proteine ​​omotača virusa, a ne virusne nukleinske kiseline.Stoga, RT-PCR test za mjerenje virusne nukleinske kiseline može značajno podcijeniti inaktivaciju virusa.Dejstvo Ag+ jona i stvaranje reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) trebalo bi da budu odgovorni za inaktivaciju testiranih virusa.Međutim, mnogi aspekti antivirusnih mehanizama AgNP-MHC su još uvijek nejasni, te su potrebna dalja istraživanja korištenjem biotehnoloških pristupa kako bi se razjasnio mehanizam visoke rezistencije AdV2.

Konačno, procijenili smo robusnost antivirusne aktivnosti Ag30-MHC tako što smo ih izložili širokom rasponu pH vrijednosti i uzorcima vode iz slavine i površinske vode prije mjerenja njihove antivirusne aktivnosti (Slika 3i​i4).4).Izlaganje ekstremno niskim pH uslovima rezultiralo je fizičkim i/ili funkcionalnim gubitkom AgNP iz MHC (neobjavljeni podaci).U prisustvu nespecifičnih čestica, Ag30-MHCs su konstantno pokazivali antivirusnu aktivnost, uprkos padu antivirusne aktivnosti protiv MS2.Antivirusna aktivnost bila je najniža u nefiltriranoj površinskoj vodi, jer je interakcija između Ag30-MHCs i nespecifičnih čestica u visoko zamućenoj površinskoj vodi vjerovatno uzrokovala smanjenje antivirusne aktivnosti (Tabela 3).Stoga, terenske procjene AgNP-MHC u različitim vrstama vode (npr. s različitim koncentracijama soli ili huminske kiseline) treba izvršiti u budućnosti.

U zaključku, novi Ag kompoziti, AgNP-MHC, imaju odlične antivirusne sposobnosti protiv nekoliko virusa, uključujući ϕX174 i MNV.AgNP-MHC održavaju snažnu efikasnost u različitim uvjetima okoline, a ove čestice se mogu lako povratiti pomoću magneta, čime se smanjuju njihovi potencijalni štetni efekti na ljudsko zdravlje i okoliš.Ova studija je pokazala da AgNP kompozit može biti efikasan antivirusni lijek u različitim okruženjima, bez značajnih ekoloških rizika.