Nanočástice stříbra (AgNP) jsou považovány za potenciálně užitečný nástroj pro kontrolu různých patogenů.Existují však obavy z uvolňování AgNP do životního prostředí, protože mohou mít nepříznivé účinky na lidské zdraví a ekologické účinky.V této studii jsme vyvinuli a vyhodnotili nový mikrometrový magnetický hybridní koloid (MHC) zdobený různě velkými AgNP (AgNP-MHC).Po aplikaci k dezinfekci mohou být tyto částice snadno získány z prostředí prostředí pomocí jejich magnetických vlastností a zůstávají účinné pro inaktivaci virových patogenů.Hodnotili jsme účinnost AgNP-MHC pro inaktivaci bakteriofága ϕX174, myšího noroviru (MNV) a adenoviru sérotypu 2 (AdV2).Tyto cílové viry byly vystaveny AgNP-MHC po dobu 1, 3 a 6 hodin při 25 °C a poté analyzovány plakovým testem a TaqMan PCR v reálném čase.AgNP-MHC byly vystaveny širokému rozsahu úrovní pH a vodovodní a povrchové vodě, aby se vyhodnotily jejich antivirové účinky za různých podmínek prostředí.Mezi třemi testovanými typy AgNP-MHC vykazovaly Ag30-MHC nejvyšší účinnost při inaktivaci virů.ϕX174 a MNV byly sníženy o více než 2 log10 po expozici 4,6 × 109 Ag30-MHCs/ml po dobu 1 hodiny.Tyto výsledky ukázaly, že AgNP-MHC by mohly být použity k inaktivaci virových patogenů s minimální pravděpodobností potenciálního uvolnění do životního prostředí.

S nedávnými pokroky v nanotechnologiích se nanočásticím po celém světě dostává zvýšené pozornosti v oblasti biotechnologie, medicíny a veřejného zdraví (1,2).Díky vysokému poměru povrchu k objemu mají nanomateriály, typicky v rozmezí od 10 do 500 nm, jedinečné fyzikálně-chemické vlastnosti ve srovnání s většími materiály (1).Tvar a velikost nanomateriálů lze kontrolovat a na jejich površích lze konjugovat specifické funkční skupiny, které umožňují interakce s určitými proteiny nebo intracelulární příjem (3,–5).

Nanočástice stříbra (AgNP) byly široce studovány jako antimikrobiální činidlo (např.6).Stříbro se používá při výrobě jemných příborů, pro zdobení a v terapeutických prostředcích.Sloučeniny stříbra, jako je sulfadiazin stříbrný a některé soli, se díky svým antimikrobiálním vlastnostem používají jako produkty pro péči o rány a jako léčba infekčních onemocnění (6,7).Nedávné studie odhalily, že AgNP jsou velmi účinné pro inaktivaci různých typů bakterií a virů (8,–11).AgNP a Ag+ ionty uvolněné z AgNP interagují přímo s biomolekulami obsahujícími fosfor nebo síru, včetně DNA, RNA a proteinů (12,–14).Bylo také prokázáno, že vytvářejí reaktivní formy kyslíku (ROS), které způsobují poškození membrán v mikroorganismech (15).Velikost, tvar a koncentrace AgNP jsou také důležitými faktory, které ovlivňují jejich antimikrobiální schopnosti (8,10,13,16,17).

Předchozí studie také zdůraznily několik problémů, když se AgNP používají pro kontrolu patogenů ve vodním prostředí.Za prvé, existující studie o účinnosti AgNP pro inaktivaci virových patogenů ve vodě jsou omezené.Kromě toho monodispergované AgNP typicky podléhají agregaci částice-částice kvůli jejich malé velikosti a velkému povrchu a tyto agregáty snižují účinnost AgNP proti mikrobiálním patogenům (7).Konečně bylo prokázáno, že AgNP mají různé cytotoxické účinky (5,18,–20) a uvolňování AgNP do vodního prostředí by mohlo mít za následek lidské zdraví a ekologické problémy.

Nedávno jsme vyvinuli nový mikrometrový magnetický hybridní koloid (MHC) zdobený AgNP různých velikostí (21,22).Jádro MHC lze použít k obnově kompozitů AgNP z prostředí.Hodnotili jsme antivirovou účinnost těchto nanočástic stříbra na MHC (AgNP-MHC) pomocí bakteriofága ϕX174, myšího noroviru (MNV) a adenoviru za různých podmínek prostředí.

Antivirové účinky AgNP-MHC v různých koncentracích proti bakteriofágu ϕX174 (a), MNV (b) a AdV2 (c).Cílové viry byly ošetřeny různými koncentracemi AgNP-MHC a OH-MHC (4,6 x 109 částic/ml) jako kontrolou v třepaném inkubátoru (150 ot./min, 1 h, 25 °C).K měření přežívajících virů byla použita metoda plakového testu.Hodnoty jsou průměry ± standardní odchylky (SD) ze tří nezávislých experimentů.Hvězdičky označují výrazně odlišné hodnoty (P< 0,05 jednocestnou ANOVA s Dunnettovým testem).

Tato studie prokázala, že AgNP-MHC jsou účinné pro inaktivaci bakteriofágů a MNV, náhrady za lidský norovirus, ve vodě.Kromě toho lze AgNP-MHC snadno získat pomocí magnetu, což účinně brání uvolňování potenciálně toxických AgNP do životního prostředí.Řada předchozích studií ukázala, že koncentrace a velikost částic AgNP jsou kritickými faktory pro inaktivaci cílených mikroorganismů (např.8,16,17).Antimikrobiální účinky AgNP závisí také na typu mikroorganismu.Účinnost AgNP-MHC pro inaktivaci ϕX174 sledovala vztah mezi dávkou a odezvou.Mezi testovanými AgNP-MHC měly Ag30-MHC vyšší účinnost pro inaktivaci ϕX174 a MNV.U MNV vykazovaly antivirovou aktivitu pouze Ag30-MHC, přičemž ostatní AgNP-MHC nevytvářely žádnou významnou inaktivaci MNV.Žádný z AgNP-MHC neměl žádnou významnou antivirovou aktivitu proti AdV2.

Kromě velikosti částic byla důležitá také koncentrace stříbra v AgNP-MHC.Zdá se, že koncentrace stříbra určuje účinnost antivirových účinků AgNP-MHC.Koncentrace stříbra v roztocích Ag07-MHC a Ag30-MHC při 4,6 × 109 částic/ml byly 28,75 ppm a 200 ppm a korelovaly s úrovní antivirové aktivity.Tabulka 2shrnuje koncentrace stříbra a povrchové plochy testovaných AgNP-MHC.Ag07-MHC vykazovaly nejnižší antivirovou aktivitu a měly nejnižší koncentraci stříbra a povrchovou plochu, což naznačuje, že tyto vlastnosti souvisí s antivirovou aktivitou AgNP-MHC.

Naše předchozí studie ukázala, že hlavními antimikrobiálními mechanismy AgNP-MHC jsou chemické abstrakce iontů Mg2+ nebo Ca2+ z mikrobiálních membrán, tvorba komplexů s thiolovými skupinami umístěnými na membránách a tvorba reaktivních forem kyslíku (ROS) (21).Protože AgNP-MHC mají relativně velkou velikost částic (~500 nm), je nepravděpodobné, že by mohly proniknout do virové kapsidy.Místo toho se zdá, že AgNP-MHC interagují s virovými povrchovými proteiny.AgNP na kompozitech mají tendenci vázat biomolekuly obsahující thiolovou skupinu zabudované do obalových proteinů virů.Proto jsou biochemické vlastnosti virových kapsidových proteinů důležité pro stanovení jejich citlivosti k AgNP-MHC.Obrázek 1ukazuje různou citlivost virů na účinky AgNP-MHC.Bakteriofágy ϕX174 a MNV byly citlivé na AgNP-MHC, ale AdV2 byl rezistentní.Vysoká úroveň odolnosti AdV2 bude pravděpodobně spojena s jeho velikostí a strukturou.Adenoviry se pohybují ve velikosti od 70 do 100 nm (30), což je činí mnohem většími než ϕX174 (27 až 33 nm) a MNV (28 až 35 nm) (31,32).Kromě své velké velikosti mají adenoviry na rozdíl od jiných virů dvouvláknovou DNA a jsou odolné vůči různým environmentálním stresům, jako je teplo a UV záření (33,34).Naše předchozí studie uvedla, že téměř 3-log10 snížení MS2 nastalo s Ag30-MHC během 6 hodin (21).MS2 a ϕX174 mají podobné velikosti s různými typy nukleových kyselin (RNA nebo DNA), ale mají podobné rychlosti inaktivace Ag30-MHC.Proto se povaha nukleové kyseliny nezdá být hlavním faktorem pro rezistenci vůči AgNP-MHC.Místo toho se zdálo, že důležitější je velikost a tvar virové částice, protože adenovirus je mnohem větší virus.Ag30-MHC dosáhly téměř 2-log10 snížení M13 během 6 hodin (naše nepublikovaná data).M13 je jednovláknový DNA virus (35) a je ∼880 nm na délku a 6,6 nm v průměru (36).Rychlost inaktivace vláknitého bakteriofága M13 byla mezi mírou inaktivace malých virů s kulatou strukturou (MNV, ϕX174 a MS2) a velkého viru (AdV2).

V této studii byla kinetika inaktivace MNV významně odlišná v testu plaků a testu RT-PCR (Obr. 2baac).c).Je známo, že molekulární testy, jako je RT-PCR, významně podhodnocují míru inaktivace virů (25,28), jak bylo zjištěno v naší studii.Protože AgNP-MHC interagují primárně s virovým povrchem, je pravděpodobnější, že poškodí obalové proteiny viru spíše než virové nukleové kyseliny.Proto může test RT-PCR pro měření virové nukleové kyseliny významně podceňovat inaktivaci virů.Za inaktivaci testovaných virů by měl být zodpovědný účinek Ag+ iontů a tvorba reaktivních forem kyslíku (ROS).Mnoho aspektů antivirových mechanismů AgNP-MHC je však stále nejasných a k objasnění mechanismu vysoké rezistence AdV2 je zapotřebí dalšího výzkumu využívajícího biotechnologické přístupy.

Nakonec jsme vyhodnotili robustnost antivirové aktivity Ag30-MHC tak, že jsme je vystavili širokému rozsahu hodnot pH a vzorkům vodovodní a povrchové vody před měřením jejich antivirové aktivity (Obraa 4).4).Expozice podmínkám extrémně nízkého pH vedla k fyzické a/nebo funkční ztrátě AgNP z MHC (nepublikovaná data).V přítomnosti nespecifických částic vykazovaly Ag30-MHC konzistentně antivirovou aktivitu, navzdory poklesu antivirové aktivity proti MS2.Antivirová aktivita byla nejnižší v nefiltrované povrchové vodě, protože interakce mezi Ag30-MHC a nespecifickými částicemi ve vysoce zakalené povrchové vodě pravděpodobně způsobila snížení antivirové aktivity (Tabulka 3).Proto by měla být v budoucnu prováděna terénní hodnocení AgNP-MHC v různých typech vod (např. s různou koncentrací solí nebo huminové kyseliny).

Závěrem lze říci, že nové Ag kompozity, AgNP-MHC, mají vynikající antivirové schopnosti proti několika virům, včetně ϕX174 a MNV.AgNP-MHC si zachovávají silnou účinnost za různých podmínek prostředí a tyto částice lze snadno získat pomocí magnetu, čímž se sníží jejich potenciální škodlivé účinky na lidské zdraví a životní prostředí.Tato studie ukázala, že kompozit AgNP může být účinným antivirotikem v různých prostředích bez významných ekologických rizik.