JavaScript er i øjeblikket deaktiveret i din browser.Når javascript er deaktiveret, vil nogle funktioner på denne hjemmeside ikke fungere.
Registrer dine specifikke detaljer og specifikke lægemidler af interesse, og vi vil matche de oplysninger, du giver, med artikler i vores omfattende database og sende dig en PDF-kopi via e-mail rettidigt.
Er mindre nanopartikler altid bedre?Forstå de biologiske effekter af størrelsesafhængig aggregering af sølvnanopartikler under biologisk relevante forhold
Forfattere: Bélteky P, Rónavári A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Kónya Z
Péter Bélteky,1,* Andrea Rónavári,1,* Dalma Zakupszky,1 Eszter Boka,1 Nóra Igaz,2 Bettina Szerencsés,3 Ilona Pfeiffer,3 Csaba Vágvölgyi,3 Mónika Kiricsi fra Environmental Chemistry, Ungarn for Videnskab og Informatik, Ungarn , Universitetet i Szeged;2 Institut for Biokemi og Molekylær Biologi, Fakultet for Naturvidenskab og Information, Universitetet i Szeged, Ungarn;3 Institut for Mikrobiologi, Fakultet for Naturvidenskab og Information, Universitetet i Szeged, Ungarn;4MTA-SZTE Reaction Kinetics and Surface Chemistry Research Group, Szeged, Ungarn* Disse forfattere bidrog lige så meget til dette arbejde.Kommunikation: Zoltán Kónya Institut for Anvendt Kemi og Miljøkemi, Fakultet for Naturvidenskab og Informatik, Universitetet i Szeged, Rerrich Square 1, Szeged, H-6720, Ungarn Telefon +36 62 544620 E-mail [E-mailbeskyttelse] Formål: Sølvnanopartikler (AgNP'er) er et af de mest almindeligt studerede nanomaterialer, især på grund af deres biomedicinske anvendelser.Men på grund af aggregeringen af ​​nanopartikler er deres fremragende cytotoksicitet og antibakterielle aktivitet ofte kompromitteret i biologiske medier.I dette arbejde blev aggregeringsadfærden og relaterede biologiske aktiviteter af tre forskellige citratterminerede sølvnanopartikelprøver med en gennemsnitlig diameter på 10, 20 og 50 nm undersøgt.Metode: Brug transmissionselektronmikroskop til at syntetisere og karakterisere nanopartikler, evaluere deres aggregeringsadfærd ved forskellige pH-værdier, NaCl, glukose og glutaminkoncentrationer ved dynamisk lysspredning og ultraviolet-synlig spektroskopi.Derudover forbedrer komponenter som Dulbecco i cellekulturmediet aggregeringsadfærden i Eagle Medium og Fetal Calf Serum.Resultater: Resultaterne viser, at sur pH og fysiologisk elektrolytindhold generelt inducerer aggregering i mikronskala, som kan medieres af dannelsen af ​​biomolekylær korona.Det er værd at bemærke, at større partikler udviser højere modstand mod ydre påvirkninger end deres mindre modstykker.In vitro cytotoksicitet og antibakterielle tests blev udført ved at behandle celler med nanopartikelaggregater på forskellige aggregeringsstadier.Konklusion: Vores resultater afslører en dybtgående sammenhæng mellem kolloid stabilitet og toksiciteten af ​​AgNP'er, da ekstrem aggregering fører til fuldstændigt tab af biologisk aktivitet.Den højere grad af anti-aggregering, der observeres for større partikler, har en signifikant indvirkning på in vitro-toksicitet, fordi sådanne prøver bevarer mere antimikrobiel og pattedyrscelleaktivitet.Disse resultater fører til den konklusion, at på trods af den generelle mening i den relevante litteratur, er målretning mod de mindst mulige nanopartikler måske ikke den bedste fremgangsmåde.Nøgleord: frø-medieret vækst, kolloid stabilitet, størrelsesafhængig aggregeringsadfærd, aggregeringsskade toksicitet
Efterhånden som efterspørgslen og produktionen af ​​nanomaterialer fortsætter med at stige, er der mere og mere opmærksomhed på deres biosikkerhed eller biologiske aktivitet.Sølvnanopartikler (AgNP'er) er en af ​​de mest almindeligt syntetiserede, forskede og brugte repræsentanter for denne klasse af materialer på grund af deres fremragende katalytiske, optiske og biologiske egenskaber.1 Det antages generelt, at de unikke egenskaber ved nanomaterialer (inklusive AgNP'er) hovedsageligt tilskrives deres store specifikke overfladeareal.Derfor er det uundgåeligt problem enhver proces, der påvirker denne nøglefunktion, såsom partikelstørrelse, overfladebelægning eller aggregering, om det vil alvorligt skade egenskaberne af nanopartikler, der er kritiske for specifikke applikationer.
Virkningerne af partikelstørrelse og stabilisatorer er emner, der er relativt veldokumenterede i litteraturen.For eksempel er den generelt accepterede opfattelse, at mindre nanopartikler er mere giftige end større nanopartikler.2 I overensstemmelse med generel litteratur har vores tidligere undersøgelser vist den størrelsesafhængige aktivitet af nanosølv på pattedyrsceller og mikroorganismer.3– 5 Overfladebelægning er en anden egenskab, der har en bred indflydelse på nanomaterialers egenskaber.Bare ved at tilføje eller modificere stabilisatorer på overfladen, kan det samme nanomateriale have helt forskellige fysiske, kemiske og biologiske egenskaber.Anvendelsen af ​​dækningsmidler udføres oftest som en del af nanopartikelsyntese.Eksempelvis er citratterminerede sølvnanopartikler en af ​​de mest relevante AgNP'er i forskningen, som syntetiseres ved at reducere sølvsalte i en udvalgt stabilisatoropløsning som reaktionsmedium.6 Citrat kan nemt drage fordel af dets lave omkostninger, tilgængelighed, biokompatibilitet og stærke affinitet for sølv, hvilket kan afspejles i forskellige foreslåede interaktioner, fra reversibel overfladeadsorption til ioniske interaktioner.Små molekyler og polyatomære ioner nær 7,8, såsom citrater, polymerer, polyelektrolytter og biologiske midler, bruges også almindeligvis til at stabilisere nano-sølv og udføre unikke funktionaliseringer på det.9-12
Selvom muligheden for at ændre aktiviteten af ​​nanopartikler ved bevidst overfladeafdækning er et meget interessant område, er hovedrollen for denne overfladebelægning ubetydelig, hvilket giver kolloid stabilitet for nanopartikelsystemet.Det store specifikke overfladeareal af nanomaterialer vil producere stor overfladeenergi, hvilket hindrer systemets termodynamiske evne til at nå sin minimumsenergi.13 Uden ordentlig stabilisering kan dette føre til agglomerering af nanomaterialer.Aggregation er dannelsen af ​​aggregater af partikler af forskellige former og størrelser, der opstår, når spredte partikler mødes, og nuværende termodynamiske interaktioner tillader partiklerne at klæbe til hinanden.Derfor bruges stabilisatorer til at forhindre aggregering ved at indføre en tilstrækkelig stor frastødende kraft mellem partiklerne til at modvirke deres termodynamiske tiltrækning.14
Selvom emnet partikelstørrelse og overfladedækning er blevet grundigt undersøgt i forbindelse med dets regulering af biologiske aktiviteter udløst af nanopartikler, er partikelaggregering et stort set forsømt område.Der er næsten ingen grundig undersøgelse til at løse den kolloide stabilitet af nanopartikler under biologisk relevante forhold.10,15-17 Derudover er dette bidrag særligt sjældent, hvor toksiciteten forbundet med aggregering også er blevet undersøgt, selvom det kan forårsage uønskede reaktioner, såsom vaskulær trombose, eller tab af ønskede egenskaber, såsom dets toksicitet, som f.eks. vist i figur 1.18, 19 vist.Faktisk er en af ​​de få kendte mekanismer for sølvnanopartikelresistens relateret til aggregering, fordi visse E. coli- og Pseudomonas aeruginosa-stammer rapporteres at reducere deres nano-sølvfølsomhed ved at udtrykke proteinet flagellin, flagellin.Det har en høj affinitet til sølv, hvilket inducerer aggregering.20
Der er flere forskellige mekanismer relateret til toksiciteten af ​​sølvnanopartikler, og aggregering påvirker alle disse mekanismer.Den mest diskuterede metode til AgNP biologisk aktivitet, nogle gange omtalt som den "trojanske hest" mekanisme, betragter AgNP'er som Ag+ bærere.1,21 Den trojanske hestemekanisme kan sikre en stor stigning i den lokale Ag+ koncentration, hvilket fører til generering af ROS og membrandepolarisering.22-24 Aggregation kan påvirke frigivelsen af ​​Ag+ og derved påvirke toksiciteten, fordi den reducerer den effektive aktive overflade, hvor sølvioner kan oxideres og opløses.AgNP'er vil dog ikke kun udvise toksicitet gennem ionfrigivelse.Mange størrelse og morfologi-relaterede interaktioner skal tages i betragtning.Blandt dem er størrelsen og formen af ​​nanopartikeloverfladen de definerende egenskaber.4,25 Samlingen af ​​disse mekanismer kan kategoriseres som "inducerede toksicitetsmekanismer."Der er potentielt mange mitokondrie- og overflademembranreaktioner, der kan beskadige organeller og forårsage celledød.25-27 Da dannelsen af ​​aggregater naturligt påvirker størrelsen og formen af ​​sølvholdige objekter, der genkendes af levende systemer, kan disse interaktioner også blive påvirket.
I vores tidligere papir om aggregering af sølvnanopartikler demonstrerede vi en effektiv screeningsprocedure bestående af kemiske og in vitro biologiske eksperimenter for at studere dette problem.19 Dynamisk lysspredning (DLS) er den foretrukne teknik til disse typer inspektioner, fordi materialet kan sprede fotoner ved en bølgelængde, der kan sammenlignes med størrelsen af ​​dets partikler.Da den Brownske bevægelseshastighed af partikler i det flydende medium er relateret til størrelsen, kan ændringen i intensiteten af ​​spredt lys bruges til at bestemme den gennemsnitlige hydrodynamiske diameter (Z-middelværdi) af væskeprøven.28 Desuden kan nanopartiklernes zeta-potentiale (ζ-potentiale) ved at påføre en spænding på prøven måles på samme måde som Z-gennemsnitsværdien.13,28 Hvis den absolutte værdi af zeta-potentialet er høj nok (ifølge generelle retningslinjer > ±30 mV), vil det generere kraftig elektrostatisk frastødning mellem partiklerne for at modvirke aggregeringen.Karakteristisk overfladeplasmonresonans (SPR) er et unikt optisk fænomen, hovedsageligt tilskrives ædelmetalnanopartikler (hovedsageligt Au og Ag).29​​ Baseret på de elektroniske oscillationer (overfladeplasmoner) af disse materialer på nanoskala, er det kendt, at sfæriske AgNP'er har en karakteristisk UV-Vis absorptionstop nær 400 nm.30 Intensiteten og bølgelængdeforskydningen af ​​partiklerne bruges til at supplere DLS-resultaterne, da denne metode kan bruges til at detektere nanopartikelaggregering og overfladeadsorption af biomolekyler.
Baseret på den opnåede information udføres cellelevedygtighed (MTT) og antibakterielle assays på en måde, hvor AgNP-toksicitet beskrives som en funktion af aggregeringsniveau, snarere end (den mest almindeligt anvendte faktor) nanopartikelkoncentration.Denne unikke metode giver os mulighed for at demonstrere den dybe betydning af aggregeringsniveau i biologisk aktivitet, fordi for eksempel citratterminerede AgNP'er fuldstændigt mister deres biologiske aktivitet inden for få timer på grund af aggregering.19
I det nuværende arbejde sigter vi mod i høj grad at udvide vores tidligere bidrag til stabiliteten af ​​bio-relaterede kolloider og deres indvirkning på biologisk aktivitet ved at studere effekten af ​​nanopartikelstørrelse på nanopartikelaggregering.Dette er uden tvivl en af ​​undersøgelserne af nanopartikler.Et højere profilperspektiv og 31 For at undersøge dette problem blev en frømedieret vækstmetode brugt til at producere citratterminerede AgNP'er i tre forskellige størrelsesområder (10, 20 og 50 nm).6,32 som en af ​​de mest almindelige metoder.For nanomaterialer, der er bredt og rutinemæssigt brugt i medicinske applikationer, vælges citratterminerede AgNP'er af forskellige størrelser for at studere den mulige størrelsesafhængighed af de aggregeringsrelaterede biologiske egenskaber af nanosølv.Efter syntetisering af AgNP'er af forskellige størrelser karakteriserede vi de producerede prøver ved transmissionselektronmikroskopi (TEM) og undersøgte derefter partiklerne ved hjælp af den førnævnte screeningsprocedure.I nærvær af in vitro cellekulturer Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) og Fetal Bovine Serum (FBS) blev den størrelsesafhængige aggregeringsadfærd og dens adfærd desuden evalueret ved forskellige pH-værdier, NaCl, glucose og glutaminkoncentrationer.Karakteristikaene for cytotoksicitet bestemmes under omfattende betingelser.Den videnskabelige konsensus indikerer, at mindre partikler generelt er at foretrække;vores undersøgelse giver en kemisk og biologisk platform til at afgøre, om dette er tilfældet.
Tre sølv nanopartikler med forskellige størrelsesområder blev fremstillet ved den frømedierede vækstmetode foreslået af Wan et al., med små justeringer.6 Denne metode er baseret på kemisk reduktion, hvor der anvendes sølvnitrat (AgNO3) som sølvkilde, natriumborhydrid (NaBH4) som reduktionsmiddel og natriumcitrat som stabilisator.Forbered først 75 mL 9 mM vandig citratopløsning fra natriumcitratdihydrat (Na3C6H5O7 x 2H2O) og opvarm til 70°C.Derefter blev 2 ml 1% vægt/volumen AgNO3-opløsning tilsat til reaktionsmediet, og derefter blev den friskfremstillede natriumborhydridopløsning (2 ml 0,1% vægt/volumen) hældt i blandingen dråbevis.Den resulterende gulbrune suspension blev holdt ved 70°C under kraftig omrøring i 1 time og derefter afkølet til stuetemperatur.Den resulterende prøve (benævnt AgNP-I fra nu af) bruges som basis for frømedieret vækst i det næste syntesetrin.
For at syntetisere en mellemstor partikelsuspension (betegnet som AgNP-II), opvarme 90 ml 7,6 mM citratopløsning til 80 °C, bland den med 10 ml AgNP-I og bland derefter 2 ml 1 % w/v AgNO3-opløsningen blev holdt under kraftig mekanisk omrøring i 1 time, og derefter blev prøven afkølet til stuetemperatur.
For den største partikel (AgNP-III), gentag den samme vækstproces, men i dette tilfælde skal du bruge 10 ml AgNP-II som frøsuspensionen.Efter at prøverne har nået stuetemperatur, indstiller de deres nominelle Ag-koncentration baseret på det totale AgNO3-indhold til 150 ppm ved at tilsætte eller fordampe yderligere opløsningsmiddel ved 40°C og til sidst opbevare dem ved 4°C indtil videre brug.
Brug FEI Tecnai G2 20 X-Twin Transmission Electron Microscope (TEM) (FEI Corporate Headquarters, Hillsboro, Oregon, USA) med 200 kV accelerationsspænding til at undersøge de morfologiske karakteristika af nanopartikler og fange deres elektrondiffraktionsmønster (ED).Mindst 15 repræsentative billeder (~750 partikler) blev evalueret ved hjælp af ImageJ-softwarepakken, og de resulterende histogrammer (og alle grafer i hele undersøgelsen) blev oprettet i OriginPro 2018 (OriginLab, Northampton, MA, USA) 33, 34.
Den gennemsnitlige hydrodynamiske diameter (Z-gennemsnit), zeta-potentiale (ζ-potentiale) og karakteristisk overfladeplasmonresonans (SPR) af prøverne blev målt for at illustrere deres oprindelige kolloide egenskaber.Prøvens gennemsnitlige hydrodynamiske diameter og zeta-potentiale blev målt med Malvern Zetasizer Nano ZS-instrumentet (Malvern Instruments, Malvern, UK) under anvendelse af foldede engangskapillærceller ved 37±0,1°C.Ocean Optics 355 DH-2000-BAL UV-Vis-spektrofotometer (Halma PLC, Largo, FL, USA) blev brugt til at opnå karakteristiske SPR-karakteristika fra UV-Vis-absorptionsspektrene for prøver i området 250-800 nm.
Under hele forsøget blev tre forskellige måletyper relateret til kolloid stabilitet udført på samme tid.Brug DLS til at måle den gennemsnitlige hydrodynamiske diameter (Z-gennemsnit) og zeta-potentiale (ζ-potentiale) af partiklerne, fordi Z-gennemsnittet er relateret til den gennemsnitlige størrelse af nanopartikelaggregaterne, og zeta-potentialet angiver, om den elektrostatiske frastødning i systemet er stærk nok til at opveje Van der Waals tiltrækning mellem nanopartikler.Målinger udføres i tre eksemplarer, og standardafvigelsen af ​​Z-middelværdi og zeta-potentiale beregnes af Zetasizer-software.De karakteristiske SPR-spektre for partiklerne vurderes ved UV-Vis-spektroskopi, fordi ændringer i spidsintensitet og bølgelængde kan indikere aggregering og overfladeinteraktioner.29,35 Faktisk er overfladeplasmonresonans i ædelmetaller så indflydelsesrig, at den har ført til nye metoder til analyse af biomolekyler.29,36,37 Koncentrationen af ​​AgNP'er i forsøgsblandingen er ca. 10 ppm, og formålet er at indstille intensiteten af ​​den maksimale initiale SPR-absorption til 1. Forsøget blev udført på en tidsafhængig måde ved 0;1,5;3;6;12 og 24 timer under forskellige biologisk relevante forhold.Flere detaljer, der beskriver eksperimentet, kan ses i vores tidligere arbejde.19 Kort sagt forskellige pH-værdier (3; 5; 7,2 og 9), forskellige natriumchlorid- (10 mM; 50 mM; 150 mM), glucose (3,9 mM; 6,7 mM) og glutamin (4 mM) koncentrationer, og også fremstillet Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) og Fetal Bovine Serum (FBS) (i vand og DMEM) som modelsystemer og undersøgte deres virkninger på aggregeringsadfærden af ​​de syntetiserede sølvnanopartikler.pH Værdierne af NaCl, glucose og glutamin vurderes ud fra fysiologiske koncentrationer, mens mængderne af DMEM og FBS er de samme som niveauerne brugt i hele in vitro eksperimentet.38-42 Alle målinger blev udført ved pH 7,2 og 37°C med en konstant baggrundssaltkoncentration på 10 mM NaCl for at eliminere eventuelle langdistance-partikelinteraktioner (bortset fra visse pH- og NaCl-relaterede eksperimenter, hvor disse attributter er variablerne under undersøgelse).28 Listen over forskellige forhold er opsummeret i tabel 1. Forsøget markeret med † bruges som reference og svarer til en prøve indeholdende 10 mM NaCl og pH 7,2.
Human prostatacancercellelinje (DU145) og udødeliggjorte humane keratinocytter (HaCaT) blev opnået fra ATCC (Manassas, VA, USA).Celler dyrkes rutinemæssigt i Dulbeccos minimum essentielle medium Eagle (DMEM) indeholdende 4,5 g/l glucose (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), suppleret med 10 % FBS, 2 mM L-glutamin, 0,01 % streptomycin og 0,005 % Penicillin (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA).Cellerne dyrkes i en 37°C inkubator under 5 % CO2 og 95 % fugtighed.
For at udforske ændringerne i AgNP-cytotoksicitet forårsaget af partikelaggregering på en tidsafhængig måde, blev der udført et to-trins MTT-assay.Først blev levedygtigheden af ​​de to celletyper målt efter behandling med AgNP-I, AgNP-II og AgNP-III.Til dette formål blev de to typer celler podet i 96-brøndsplader med en tæthed på 10.000 celler/brønd og behandlet med tre forskellige størrelser af sølvnanopartikler i stigende koncentrationer på den anden dag.Efter 24 timers behandling blev cellerne vasket med PBS og inkuberet med 0,5 mg/ml MTT-reagens (SERVA, Heidelberg, Tyskland) fortyndet i dyrkningsmedium i 1 time ved 37°C.Formazan-krystaller blev opløst i DMSO (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), og absorptionen blev målt ved 570 nm under anvendelse af en Synergy HTX-pladelæser (BioTek-Hungary, Budapest, Ungarn).Absorptionsværdien af ​​den ubehandlede kontrolprøve anses for at være 100 % overlevelsesrate.Udfør mindst 3 eksperimenter med fire uafhængige biologiske replikater.IC50 beregnes ud fra en dosisresponskurve baseret på vitalitetsresultater.
Derefter, i det andet trin, ved at inkubere partiklerne med 150 mM NaCl i forskellige tidsrum (0, 1,5, 3, 6, 12 og 24 timer) før cellebehandling, blev der produceret forskellige aggregeringstilstande af sølvnanopartikler.Efterfølgende blev det samme MTT-assay udført som tidligere beskrevet for at evaluere ændringer i cellelevedygtighed påvirket af partikelaggregation.Brug GraphPad Prism 7 til at evaluere det endelige resultat, beregne den statistiske signifikans af eksperimentet ved uparret t-test, og marker dets niveau som * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01), *** (p ≤ 0,001 ) Og **** (p ≤ 0,0001).
Tre forskellige størrelser af sølvnanopartikler (AgNP-I, AgNP-II og AgNP-III) blev brugt til antibakteriel modtagelighed over for Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM; Research Center for Pathogenic Fungi and Microbial Toxicology, Chiba University) og Bacillus Test megaterium SZMC 6031 (SZMC: Szeged Microbiology Collection) og E. coli SZMC 0582 i RPMI 1640-medium (Sigma-Aldrich Co.).For at evaluere ændringerne i antibakteriel aktivitet forårsaget af aggregering af partikler, blev deres minimale inhiberende koncentration (MIC) først bestemt ved mikrofortynding i en 96-brønds mikrotiterplade.Til 50 μL standardiseret cellesuspension (5 × 104 celler/ml i RPMI 1640-medium), tilsæt 50 μL sølvnanopartikelsuspension og seriefortynd to gange koncentrationen (i det førnævnte medium er intervallet 0 og 75 ppm, dvs. kontrolprøven indeholder 50 μL cellesuspension og 50 μL medium uden nanopartikler).Derefter blev pladen inkuberet ved 30°C i 48 timer, og kulturens optiske tæthed blev målt ved 620 nm under anvendelse af en SPECTROstar Nano-pladelæser (BMG LabTech, Offenburg, Tyskland).Forsøget blev udført tre gange i tre eksemplarer.
Bortset fra at 50 μL enkelte aggregerede nanopartikelprøver blev brugt på dette tidspunkt, blev den samme procedure som tidligere beskrevet brugt til at undersøge effekten af ​​aggregering på antibakteriel aktivitet på de førnævnte stammer.Forskellige aggregeringstilstande af sølvnanopartikler produceres ved at inkubere partiklerne med 150 mM NaCl i forskellige tidsperioder (0, 1,5, 3, 6, 12 og 24 timer) før cellebehandling.En suspension suppleret med 50 μL RPMI 1640-medium blev brugt som vækstkontrol, mens der for at kontrollere toksicitet blev anvendt en suspension med ikke-aggregerede nanopartikler.Forsøget blev udført tre gange i tre eksemplarer.Brug GraphPad Prism 7 til at evaluere det endelige resultat igen ved at bruge den samme statistiske analyse som MTT-analysen.
Aggregeringsniveauet for de mindste partikler (AgNP-I) er blevet karakteriseret, og resultaterne blev delvist offentliggjort i vores tidligere arbejde, men for en bedre sammenligning blev alle partikler grundigt screenet.De eksperimentelle data indsamles og diskuteres i de følgende afsnit.Tre størrelser af AgNP.19
Målinger udført af TEM, UV-Vis og DLS bekræftede den vellykkede syntese af alle AgNP-prøver (figur 2A-D).Ifølge den første række i figur 2 viser den mindste partikel (AgNP-I) en ensartet sfærisk morfologi med en gennemsnitlig diameter på ca. 10 nm.Den frømedierede vækstmetode giver også AgNP-II og AgNP-III forskellige størrelsesområder med gennemsnitlige partikeldiametre på henholdsvis ca. 20 nm og 50 nm.Ifølge standardafvigelsen af ​​partikelfordelingen overlapper størrelserne af de tre prøver ikke, hvilket er vigtigt for deres sammenlignende analyse.Ved at sammenligne det gennemsnitlige aspektforhold og tyndhedsforhold for TEM-baserede partikel 2D-projektioner, antages det, at partiklernes sfæriske karakter evalueres af ImageJs formfilterplug-in (figur 2E).43 Ifølge analysen af ​​partiklernes form påvirkes deres aspektforhold (stor side/kortside af det mindste afgrænsende rektangel) ikke af partikelvækst, og deres tyndhedsforhold (målt areal af den tilsvarende perfekte cirkel/teoretiske areal ) falder gradvist.Dette resulterer i flere og flere polyedriske partikler, som i teorien er perfekt runde, svarende til et tyndhedsforhold på 1.
Figur 2 Transmissionselektronmikroskop (TEM) billede (A), elektrondiffraktion (ED) mønster (B), størrelsesfordelingshistogram (C), karakteristisk ultraviolet-synligt (UV-Vis) lysabsorptionsspektrum (D) og gennemsnitlig væskecitrat -terminerede sølvnanopartikler med mekanisk diameter (Z-gennemsnit), zeta-potentiale, aspektforhold og tykkelsesforhold (E) har tre forskellige størrelsesområder: AgNP-I er 10 nm (øverste række), AgNP -II er 20 nm (midterste række). AgNP-III (nederste række) er 50 nm.
Selvom vækstmetodens cykliske natur påvirkede partikelformen til en vis grad, hvilket resulterede i den mindre sfæricitet af større AgNP'er, forblev alle tre prøver kvasi-sfæriske.Derudover, som vist i elektrondiffraktionsmønsteret i figur 2B, nano. Krystalliniteten af ​​partiklerne påvirkes ikke.Den fremtrædende diffraktionsring - som kan korreleres med (111), (220), (200) og (311) Miller-indekser for sølv - er meget i overensstemmelse med den videnskabelige litteratur og vores tidligere bidrag.9, 19,44 Fragmenteringen af ​​Debye-Scherrer-ringen af ​​AgNP-II og AgNP-III skyldes, at ED-billedet optages med samme forstørrelse, så efterhånden som partikelstørrelsen stiger, vil antallet af diffrakterede partikler pr. enhedsareal stiger og falder.
Størrelsen og formen af ​​nanopartikler er kendt for at påvirke biologisk aktivitet.3,45 Formafhængig katalytisk og biologisk aktivitet kan forklares ved, at forskellige former har en tendens til at formere visse krystalflader (med forskellige Miller-indekser), og disse krystalflader har forskellige aktiviteter.45,46 Da de præparerede partikler giver lignende ED-resultater svarende til meget lignende krystalkarakteristika, kan det antages, at i vores efterfølgende kolloide stabilitets- og biologiske aktivitetseksperimenter, bør eventuelle observerede forskelle tilskrives nanopartikelstørrelse, ikke formrelaterede egenskaber.
UV-Vis-resultaterne opsummeret i figur 2D understreger yderligere den overvældende sfæriske natur af det syntetiserede AgNP, fordi SPR-toppene for alle tre prøver er omkring 400 nm, hvilket er en karakteristisk værdi af sfæriske sølvnanopartikler.29,30 De fangede spektre bekræftede også den vellykkede frømedierede vækst af nanosølv.Efterhånden som partikelstørrelsen øges, vil bølgelængden svarende til den maksimale lysabsorption af AgNP-II-mere fremtrædende-Ifølge litteraturen oplevede AgNP-III en rødforskydning.6,29
Med hensyn til den indledende kolloide stabilitet af AgNP-systemet blev DLS brugt til at måle den gennemsnitlige hydrodynamiske diameter og zeta-potentiale af partiklerne ved pH 7,2.Resultaterne afbildet i figur 2E viser, at AgNP-III har højere kolloid stabilitet end AgNP-I eller AgNP-II, fordi fælles retningslinjer indikerer, at et zeta-potentiale på 30 mV absolut er nødvendigt for langsigtet kolloid stabilitet. Dette fund understøttes yderligere, når Z-gennemsnitsværdien (opnået som den gennemsnitlige hydrodynamiske diameter af frie og aggregerede partikler) sammenlignes med den primære partikelstørrelse opnået ved TEM, fordi jo tættere de to værdier er, jo mildere er graden Samling i prøven.Faktisk er Z-gennemsnittet af AgNP-I og AgNP-II rimeligt højere end deres vigtigste TEM-evaluerede partikelstørrelse, så sammenlignet med AgNP-III forventes disse prøver at være mere tilbøjelige til at aggregere, hvor det meget negative zeta-potentiale er ledsaget af en tæt størrelse Z-gennemsnitsværdien.
Forklaringen på dette fænomen kan være todelt.På den ene side holdes citratkoncentrationen på et lignende niveau i alle syntesetrin, hvilket giver en relativt høj mængde ladede overfladegrupper for at forhindre det specifikke overfladeareal af de voksende partikler i at falde.Men ifølge Levak et al. kan små molekyler som citrat let udskiftes af biomolekyler på overfladen af ​​nanopartiklerne.I dette tilfælde vil den kolloide stabilitet blive bestemt af coronaen af ​​de producerede biomolekyler.31 Fordi denne adfærd også blev observeret i vores aggregeringsmålinger (diskuteret mere detaljeret senere), kan citratafdækning alene ikke forklare dette fænomen.
På den anden side er partikelstørrelsen omvendt proportional med aggregeringstendensen på nanometerniveau.Dette understøttes hovedsageligt af den traditionelle Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO) metode, hvor partikeltiltrækning beskrives som summen af ​​tiltræknings- og frastødende kræfter mellem partikler.Ifølge He et al. falder den maksimale værdi af DLVO-energikurven med størrelsen af ​​nanopartiklerne i hæmatitnanopartiklerne, hvilket gør det nemmere at nå minimum primærenergi og derved fremmer irreversibel aggregering (kondensation).47 Det spekuleres imidlertid i, at der er andre aspekter ud over DLVO-teoriens begrænsninger.Selvom van der Waals tyngdekraft og elektrostatisk dobbeltlags frastødning er ens med stigende partikelstørrelse, er en anmeldelse af Hotze et al.foreslår, at det har en stærkere effekt på aggregering, end DLVO tillader.14 De mener, at overfladekrumningen af ​​nanopartikler ikke længere kan estimeres som en flad overflade, hvilket gør matematisk estimering uanvendelig.Derudover, når partikelstørrelsen falder, bliver procentdelen af ​​atomer, der er til stede på overfladen, højere, hvilket fører til elektronisk struktur og overfladeladningsadfærd.Og overfladereaktivitet ændres, hvilket kan føre til et fald i ladningen i det elektriske dobbeltlag og fremme aggregering.
Når vi sammenlignede DLS-resultaterne for AgNP-I, AgNP-II og AgNP-III i figur 3, observerede vi, at alle tre prøver viste lignende pH-anmodning om aggregering.Et stærkt surt miljø (pH 3) forskyder prøvens zeta-potentiale til 0 mV, hvilket får partikler til at danne aggregater i mikronstørrelse, mens alkalisk pH flytter sit zeta-potentiale til en større negativ værdi, hvor partiklerne danner mindre aggregater (pH 5). ).Og 7,2) ), eller forbliver fuldstændig uaggregeret (pH 9).Nogle vigtige forskelle mellem de forskellige prøver blev også observeret.AgNP-I viste sig gennem hele forsøget at være den mest følsomme over for pH-inducerede zeta-potentialeændringer, fordi zeta-potentialet for disse partikler er blevet reduceret ved pH 7,2 sammenlignet med pH 9, mens AgNP-II og AgNP-III kun viste A betydelig ændring i ζ er omkring pH 3. Derudover viste AgNP-II langsommere ændringer og moderat zeta-potentiale, mens AgNP-III viste den mildeste adfærd af de tre, fordi systemet viste den højeste absolutte zeta-værdi og langsom trendbevægelse, hvilket indikerer AgNP-III Mest modstandsdygtig over for pH-induceret aggregering.Disse resultater stemmer overens med de gennemsnitlige hydrodynamiske diametermålingsresultater.I betragtning af partikelstørrelsen af ​​deres primere udviste AgNP-I konstant gradvis aggregering ved alle pH-værdier, højst sandsynligt på grund af 10 mM NaCl-baggrunden, mens AgNP-II og AgNP-III kun viste signifikant ved pH 3 af samling.Den mest interessante forskel er, at på trods af dens store nanopartikelstørrelse danner AgNP-III de mindste aggregater ved pH 3 på 24 timer, hvilket fremhæver dets anti-aggregeringsegenskaber.Ved at dividere den gennemsnitlige Z af AgNP'er ved pH 3 efter 24 timer med værdien af ​​den forberedte prøve, kan det observeres, at de relative aggregatstørrelser af AgNP-I og AgNP-II er steget med 50 gange, 42 gange og 22 gange , henholdsvis.III.
Figur 3 De dynamiske lysspredningsresultater af den citratterminerede sølvnanopartikelprøve med stigende størrelse (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II og 50 nm: AgNP-III) er udtrykt som den gennemsnitlige hydrodynamiske diameter (Z-gennemsnit). ) (højre) Under forskellige pH-forhold ændres zeta-potentialet (venstre) inden for 24 timer.
Den observerede pH-afhængige aggregering påvirkede også den karakteristiske overfladeplasmonresonans (SPR) af AgNP-prøverne, som det fremgår af deres UV-Vis-spektre.Ifølge supplerende figur S1 efterfølges aggregeringen af ​​alle tre sølvnanopartikelsuspensioner af en reduktion i intensiteten af ​​deres SPR-toppe og et moderat rødt skift.Omfanget af disse ændringer som funktion af pH er i overensstemmelse med graden af ​​aggregering forudsagt af DLS-resultaterne, dog er nogle interessante tendenser blevet observeret.I modsætning til intuitionen viser det sig, at den mellemstore AgNP-II er den mest følsomme over for SPR-ændringer, mens de to andre prøver er mindre følsomme.I SPR-forskning er 50 nm den teoretiske partikelstørrelsesgrænse, som bruges til at skelne partikler ud fra deres dielektriske egenskaber.Partikler mindre end 50 nm (AgNP-I og AgNP-II) kan beskrives som simple dielektriske dipoler, mens partikler, der når eller overskrider denne grænse (AgNP-III) har mere komplekse dielektriske egenskaber, og deres resonans Båndet opdeles i multimodale ændringer .I tilfælde af to mindre partikelprøver kan AgNP'er betragtes som simple dipoler, og plasmaet kan let overlappe.Når partikelstørrelsen øges, producerer denne kobling i det væsentlige et større plasma, hvilket kan forklare den højere følsomhed, der observeres.29 For de største partikler er den simple dipolestimering imidlertid ikke gyldig, når andre koblingstilstande også kan forekomme, hvilket kan forklare den faldende tendens af AgNP-III til at indikere spektrale ændringer.29
Under vores eksperimentelle forhold er det bevist, at pH-værdien har en dybtgående effekt på den kolloide stabilitet af citratbelagte sølvnanopartikler af forskellige størrelser.I disse systemer tilvejebringes stabilitet af de negativt ladede -COO- grupper på overfladen af ​​AgNP'er.Den funktionelle carboxylatgruppe i citrationen er protoneret i et stort antal H+ ioner, så den dannede carboxylgruppe kan ikke længere give elektrostatisk frastødning mellem partiklerne, som vist i øverste række i figur 4. Ifølge Le Chateliers princip er AgNP prøverne aggregeres hurtigt ved pH 3, men bliver gradvist mere og mere stabile, efterhånden som pH stiger.
Figur 4 Skematisk mekanisme for overfladeinteraktion defineret ved aggregering under forskellig pH (øverste række), NaCl-koncentration (midterste række) og biomolekyler (nederste række).
Ifølge figur 5 blev den kolloide stabilitet i AgNP-suspensioner af forskellige størrelser også undersøgt under stigende saltkoncentrationer.Baseret på zeta-potentialet giver den øgede nanopartikelstørrelse i disse citratterminerede AgNP-systemer igen øget modstand mod ydre påvirkninger fra NaCl.I AgNP-I er 10 mM NaCl tilstrækkeligt til at inducere mild aggregering, og en saltkoncentration på 50 mM giver meget lignende resultater.I AgNP-II og AgNP-III påvirker 10 mM NaCl ikke zeta-potentialet signifikant, fordi deres værdier forbliver på (AgNP-II) eller under (AgNP-III) -30 mV.Forøgelse af NaCl-koncentrationen til 50 mM og til sidst til 150 mM NaCl er nok til signifikant at reducere den absolutte værdi af zeta-potentialet i alle prøver, selvom større partikler bevarer mere negativ ladning.Disse resultater er i overensstemmelse med den forventede gennemsnitlige hydrodynamiske diameter af AgNP'er;de Z gennemsnitlige trendlinjer målt på 10, 50 og 150 mM NaCl viser forskellige, gradvist stigende værdier.Endelig blev der påvist aggregater i mikronstørrelse i alle tre 150 mM eksperimenter.
Figur 5 De dynamiske lysspredningsresultater af den citratterminerede sølvnanopartikelprøve med stigende størrelse (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II og 50 nm: AgNP-III) er udtrykt som den gennemsnitlige hydrodynamiske diameter (Z-gennemsnit). ) (højre) og zeta-potentiale (venstre) ændres inden for 24 timer under forskellige NaCl-koncentrationer.
UV-Vis-resultaterne i supplerende figur S2 viser, at SPR på 50 og 150 mM NaCl i alle tre prøver har et øjeblikkeligt og signifikant fald.Dette kan forklares med DLS, fordi NaCl-baseret aggregering sker hurtigere end pH-afhængige forsøg, hvilket forklares med den store forskel mellem de tidlige (0, 1,5 og 3 timer) målinger.Derudover vil en forøgelse af saltkoncentrationen også øge forsøgsmediets relative permittivitet, hvilket vil have en dybtgående effekt på overfladeplasmonresonans.29
Effekten af ​​NaCl er opsummeret i den midterste række i figur 4. Generelt kan det konkluderes, at en forøgelse af koncentrationen af ​​natriumchlorid har en lignende effekt som at øge surhedsgraden, fordi Na+ ioner har en tendens til at koordinere sig omkring carboxylatgrupperne. undertrykke negative zetapotentiale AgNP'er.Derudover producerede 150 mM NaCl aggregater i mikronstørrelse i alle tre prøver, hvilket indikerer, at den fysiologiske elektrolytkoncentration er skadelig for den kolloide stabilitet af citratterminerede AgNP'er.Ved at overveje den kritiske kondenseringskoncentration (CCC) af NaCl på lignende AgNP-systemer, kan disse resultater på en smart måde placeres i den relevante litteratur.Huynh et al.beregnet, at CCC for NaCl for citratterminerede sølvnanopartikler med en gennemsnitlig diameter på 71 nm var 47,6 mM, mens El Badawy et al.observerede, at CCC af 10 nm AgNP'er med citratcoating var 70 mM.10,16 Derudover blev den signifikant høje CCC på omkring 300 mM målt af He et al., hvilket forårsagede, at deres syntesemetode var forskellig fra den tidligere nævnte publikation.48 Selvom det nuværende bidrag ikke er rettet mod en omfattende analyse af disse værdier, fordi vores eksperimentelle forhold er stigende i kompleksiteten af ​​hele undersøgelsen, synes den biologisk relevante NaCl-koncentration på 50 mM, især 150 mM NaCl, at være ret høj.Induceret koagulation, der forklarer de stærke ændringer, der er påvist.
Det næste trin i polymerisationsforsøget er at bruge simple, men biologisk relevante molekyler til at simulere nanopartikel-biomolekyle-interaktioner.Baseret på DLS (figur 6 og 7) og UV-Vis resultater (supplerende figurer S3 og S4), kan nogle generelle konklusioner hævdes.Under vores eksperimentelle forhold vil de undersøgte molekyler glucose og glutamin ikke inducere aggregering i noget AgNP-system, fordi Z-middel-tendensen er tæt forbundet med den tilsvarende referencemåleværdi.Selvom deres tilstedeværelse ikke påvirker aggregering, viser eksperimentelle resultater, at disse molekyler er delvist adsorberet på overfladen af ​​AgNP'er.Det mest fremtrædende resultat, der understøtter denne opfattelse, er den observerede ændring i lysabsorption.Selvom AgNP-I ikke udviser meningsfulde bølgelængde- eller intensitetsændringer, kan det observeres tydeligere ved at måle større partikler, hvilket højst sandsynligt skyldes den tidligere nævnte større optiske følsomhed.Uanset koncentrationen kan glukose forårsage et større rødt skift efter 1,5 time sammenlignet med kontrolmålingen, som er omkring 40 nm i AgNP-II og omkring 10 nm i AgNP-III, hvilket beviser forekomsten af ​​overfladeinteraktioner.Glutamin viste en lignende tendens, men ændringen var ikke så tydelig.Derudover er det også værd at nævne, at glutamin kan reducere det absolutte zeta-potentiale for mellemstore og store partikler.Men da disse zeta-ændringer ikke ser ud til at påvirke aggregeringsniveauet, kan det spekuleres i, at selv små biomolekyler som glutamin kan give en vis grad af rumlig frastødning mellem partikler.
Figur 6 De dynamiske lysspredningsresultater af citratterminerede sølvnanopartikelprøver med stigende størrelse (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II og 50 nm: AgNP-III) er udtrykt som den gennemsnitlige hydrodynamiske diameter (Z-gennemsnit) (højre) Under eksterne forhold med forskellige glukosekoncentrationer ændres zeta-potentialet (venstre) inden for 24 timer.
Figur 7 De dynamiske lysspredningsresultater af den citratterminerede sølvnanopartikelprøve med stigende størrelse (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II og 50 nm: AgNP-III) er udtrykt som den gennemsnitlige hydrodynamiske diameter (Z-gennemsnit). ) (højre) I nærvær af glutamin ændres zeta-potentialet (venstre) inden for 24 timer.
Kort sagt, små biomolekyler som glucose og glutamin påvirker ikke kolloid stabilitet ved den målte koncentration: selvom de påvirker zeta-potentialet og UV-Vis-resultaterne i varierende grad, er Z-gennemsnitsresultaterne ikke konsistente.Dette indikerer, at overfladeadsorptionen af ​​molekyler hæmmer elektrostatisk frastødning, men giver samtidig dimensionsstabilitet.
For at forbinde de tidligere resultater med de tidligere resultater og simulere biologiske forhold mere dygtigt, valgte vi nogle af de mest almindeligt anvendte cellekulturkomponenter og brugte dem som eksperimentelle betingelser for at studere stabiliteten af ​​AgNP-kolloider.I hele in vitro-eksperimentet er en af ​​de vigtigste funktioner for DMEM som medium at etablere de nødvendige osmotiske forhold, men ud fra et kemisk synspunkt er det en kompleks saltopløsning med en samlet ionstyrke svarende til 150 mM NaCl .40 Hvad angår FBS, er det en kompleks blanding af biomolekyler - hovedsageligt proteiner - set fra overfladeadsorptionssynspunktet har den nogle ligheder med de eksperimentelle resultater af glucose og glutamin, på trods af den kemiske sammensætning og mangfoldighed Køn er meget mere kompliceret.19 DLS og UV-De synlige resultater vist i henholdsvis Figur 8 og Supplerende Figur S5 kan forklares ved at undersøge den kemiske sammensætning af disse materialer og korrelere dem med målingerne i det foregående afsnit.
Figur 8 De dynamiske lysspredningsresultater af den citratterminerede sølvnanopartikelprøve med stigende størrelse (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II og 50 nm: AgNP-III) er udtrykt som den gennemsnitlige hydrodynamiske diameter (Z-gennemsnit). ) (højre) I nærvær af cellekulturkomponenter DMEM og FBS ændres zeta-potentialet (venstre) inden for 24 timer.
Fortyndingen af ​​AgNP'er af forskellige størrelser i DMEM har en lignende effekt på kolloid stabilitet som den, der observeres i nærvær af høje NaCl-koncentrationer.Dispersionen af ​​AgNP i 50 v/v% DMEM viste, at aggregering i stor skala blev detekteret med stigningen i zeta-potentiale og Z-gennemsnitsværdi og det skarpe fald i SPR-intensiteten.Det er værd at bemærke, at den maksimale aggregatstørrelse induceret af DMEM efter 24 timer er omvendt proportional med størrelsen af ​​primer-nanopartikler.
Interaktionen mellem FBS og AgNP ligner den, der observeres i nærvær af mindre molekyler såsom glucose og glutamin, men effekten er stærkere.Z-gennemsnittet af partiklerne forbliver upåvirket, mens en stigning i zeta-potentiale detekteres.SPR-toppen viste et lille rødt skift, men måske mere interessant faldt SPR-intensiteten ikke så signifikant som i kontrolmålingen.Disse resultater kan forklares ved den medfødte adsorption af makromolekyler på overfladen af ​​nanopartikler (nederste række i figur 4), som nu forstås som dannelsen af ​​biomolekylær korona i kroppen.49