Η Javascript είναι απενεργοποιημένη αυτήν τη στιγμή στο πρόγραμμα περιήγησής σας.Όταν η Javascript είναι απενεργοποιημένη, ορισμένες λειτουργίες αυτού του ιστότοπου δεν θα λειτουργούν.
Καταχωρίστε τα συγκεκριμένα στοιχεία σας και τα συγκεκριμένα φάρμακα που σας ενδιαφέρουν και θα αντιστοιχίσουμε τις πληροφορίες που παρέχετε με άρθρα στην εκτενή βάση δεδομένων μας και θα σας στείλουμε έγκαιρα ένα αντίγραφο PDF μέσω email.
Τα μικρότερα νανοσωματίδια είναι πάντα καλύτερα;Κατανόηση των βιολογικών επιπτώσεων της εξαρτώμενης από το μέγεθος συσσωμάτωσης νανοσωματιδίων αργύρου κάτω από βιολογικά σχετικές συνθήκες
Συγγραφείς: Bélteky P, Rónavári A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Kónya Z
Péter Bélteky, 1, * Andrea Rónavári, 1, * Dalma Zakupszky, 1 Eszter Boka, 1 Nóra Igaz, 2 Bettina Szerencsés, 3 Ilona Pfeiffer, 3 Csaba Vágvölgyi, 3 Mónika Kiricsi της Επιστήμης Περιβαλλοντικών Επιστημών και της Χημείας του Περιβάλλοντος , Πανεπιστήμιο του Szeged;2 Τμήμα Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, Σχολή Επιστημών και Πληροφοριών, Πανεπιστήμιο του Szeged, Ουγγαρία.3 Τμήμα Μικροβιολογίας, Σχολή Επιστημών και Πληροφοριών, Πανεπιστήμιο του Szeged, Ουγγαρία.4MTA-SZTE Reaction Kinetics and Surface Chemistry Research Group, Szeged, Ουγγαρία* Αυτοί οι συγγραφείς συνέβαλαν εξίσου σε αυτήν την εργασία.Επικοινωνία: Zoltán Kónya Τμήμα Εφαρμοσμένης και Χημείας Περιβάλλοντος, Σχολή Επιστημών και Πληροφορικής, Πανεπιστήμιο του Szeged, Rerrich Square 1, Szeged, H-6720, Ουγγαρία Τηλέφωνο +36 62 544620 Email [Email προστασία] Σκοπός: Ασημί ένα από τα πιο συχνά μελετημένα νανοϋλικά, ειδικά λόγω των βιοϊατρικών εφαρμογών τους.Ωστόσο, λόγω της συσσωμάτωσης νανοσωματιδίων, η εξαιρετική κυτταροτοξικότητα και η αντιβακτηριδιακή τους δράση συχνά διακυβεύονται στα βιολογικά μέσα.Σε αυτή την εργασία, μελετήθηκε η συμπεριφορά συσσωμάτωσης και οι σχετικές βιολογικές δραστηριότητες τριών διαφορετικών δειγμάτων νανοσωματιδίων αργύρου με τερματισμό κιτρικού με μέση διάμετρο 10, 20 και 50 nm.Μέθοδος: Χρησιμοποιήστε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης για να συνθέσετε και να χαρακτηρίσετε νανοσωματίδια, αξιολογήστε τη συμπεριφορά συσσωμάτωσης τους σε διάφορες τιμές pH, συγκεντρώσεις NaCl, γλυκόζης και γλουταμίνης με δυναμική σκέδαση φωτός και φασματοσκοπία υπεριώδους-ορατής.Επιπλέον, στο μέσο κυτταροκαλλιέργειας συστατικά όπως το Dulbecco βελτιώνουν τη συμπεριφορά συσσωμάτωσης στο Eagle Medium και στον ορό εμβρύου μόσχου.Αποτελέσματα: Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το όξινο pH και η περιεκτικότητα σε φυσιολογικούς ηλεκτρολύτες γενικά προκαλούν συσσωμάτωση σε κλίμακα μικρομέτρων, η οποία μπορεί να μεσολαβήσει από το σχηματισμό βιομοριακής κορώνας.Αξίζει να σημειωθεί ότι τα μεγαλύτερα σωματίδια παρουσιάζουν μεγαλύτερη αντίσταση σε εξωτερικές επιδράσεις από τα μικρότερα αντίστοιχα.Πραγματοποιήθηκαν in vitro κυτταροτοξικότητα και αντιβακτηριδιακές δοκιμές με επεξεργασία κυττάρων με συσσωματώματα νανοσωματιδίων σε διαφορετικά στάδια συσσωμάτωσης.Συμπέρασμα: Τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν μια βαθιά συσχέτιση μεταξύ της κολλοειδούς σταθερότητας και της τοξικότητας των AgNPs, καθώς η ακραία συσσωμάτωση οδηγεί σε πλήρη απώλεια βιολογικής δραστηριότητας.Ο υψηλότερος βαθμός αντισυσσωμάτωσης που παρατηρείται για μεγαλύτερα σωματίδια έχει σημαντικό αντίκτυπο στην in vitro τοξικότητα, επειδή τέτοια δείγματα διατηρούν περισσότερη αντιμικροβιακή και κυτταρική δραστηριότητα θηλαστικών.Αυτά τα ευρήματα οδηγούν στο συμπέρασμα ότι, παρά τη γενική άποψη στη σχετική βιβλιογραφία, η στόχευση στα μικρότερα δυνατά νανοσωματίδια μπορεί να μην είναι η καλύτερη πορεία δράσης.Λέξεις-κλειδιά: ανάπτυξη με τη μεσολάβηση των σπόρων, κολλοειδή σταθερότητα, συμπεριφορά συσσωμάτωσης εξαρτώμενης από το μέγεθος, τοξικότητα βλάβης συσσωμάτωσης
Καθώς η ζήτηση και η παραγωγή νανοϋλικών συνεχίζει να αυξάνεται, δίνεται όλο και μεγαλύτερη προσοχή στη βιοασφάλεια ή τη βιολογική τους δραστηριότητα.Τα νανοσωματίδια αργύρου (AgNPs) είναι ένας από τους πιο συχνά συντιθέμενους, ερευνημένους και χρησιμοποιούμενους εκπροσώπους αυτής της κατηγορίας υλικών λόγω των εξαιρετικών καταλυτικών, οπτικών και βιολογικών ιδιοτήτων τους.1 Πιστεύεται γενικά ότι τα μοναδικά χαρακτηριστικά των νανοϋλικών (συμπεριλαμβανομένων των AgNPs) αποδίδονται κυρίως στη μεγάλη ειδική επιφάνεια τους.Επομένως, το αναπόφευκτο πρόβλημα είναι οποιαδήποτε διεργασία που επηρεάζει αυτό το βασικό χαρακτηριστικό, όπως το μέγεθος σωματιδίων, η επιφανειακή επίστρωση ή η συσσωμάτωση, είτε θα βλάψει σοβαρά τις ιδιότητες των νανοσωματιδίων που είναι κρίσιμες για συγκεκριμένες εφαρμογές.
Οι επιδράσεις του μεγέθους των σωματιδίων και των σταθεροποιητών είναι θέματα που έχουν σχετικά καλά τεκμηριωθεί στη βιβλιογραφία.Για παράδειγμα, η γενικά αποδεκτή άποψη είναι ότι τα μικρότερα νανοσωματίδια είναι πιο τοξικά από τα μεγαλύτερα νανοσωματίδια.2 Σύμφωνα με τη γενική βιβλιογραφία, οι προηγούμενες μελέτες μας έχουν δείξει την εξαρτώμενη από το μέγεθος δραστηριότητα του νανοαργύρου σε κύτταρα και μικροοργανισμούς θηλαστικών.3– 5 Η επικάλυψη επιφάνειας είναι ένα άλλο χαρακτηριστικό που έχει ευρεία επίδραση στις ιδιότητες των νανοϋλικών.Απλά προσθέτοντας ή τροποποιώντας σταθεροποιητές στην επιφάνειά του, το ίδιο νανοϋλικό μπορεί να έχει εντελώς διαφορετικές φυσικές, χημικές και βιολογικές ιδιότητες.Η εφαρμογή παραγόντων κάλυψης πραγματοποιείται συχνότερα ως μέρος της σύνθεσης νανοσωματιδίων.Για παράδειγμα, τα νανοσωματίδια αργύρου με τερματικά κιτρικά είναι ένα από τα πιο σημαντικά AgNPs στην έρευνα, τα οποία συντίθενται με αναγωγή αλάτων αργύρου σε επιλεγμένο διάλυμα σταθεροποιητή ως μέσο αντίδρασης.6 Το κιτρικό μπορεί εύκολα να επωφεληθεί από το χαμηλό κόστος, τη διαθεσιμότητα, τη βιοσυμβατότητα και την ισχυρή του συγγένεια για τον άργυρο, η οποία μπορεί να αντικατοπτρίζεται σε διάφορες προτεινόμενες αλληλεπιδράσεις, από την αναστρέψιμη επιφανειακή προσρόφηση έως τις ιοντικές αλληλεπιδράσεις.Μικρά μόρια και πολυατομικά ιόντα κοντά στο 7,8, όπως κιτρικά άλατα, πολυμερή, πολυηλεκτρολύτες και βιολογικοί παράγοντες χρησιμοποιούνται επίσης συνήθως για τη σταθεροποίηση του νανο-αργύρου και την εκτέλεση μοναδικών λειτουργιών σε αυτόν.9-12
Αν και η πιθανότητα αλλαγής της δραστηριότητας των νανοσωματιδίων με σκόπιμη επικάλυψη επιφάνειας είναι μια πολύ ενδιαφέρουσα περιοχή, ο κύριος ρόλος αυτής της επιφανειακής επίστρωσης είναι αμελητέος, παρέχοντας κολλοειδή σταθερότητα για το σύστημα νανοσωματιδίων.Η μεγάλη ειδική επιφάνεια των νανοϋλικών θα παράγει μεγάλη επιφανειακή ενέργεια, η οποία εμποδίζει τη θερμοδυναμική ικανότητα του συστήματος να φτάσει την ελάχιστη ενέργειά του.13 Χωρίς την κατάλληλη σταθεροποίηση, αυτό μπορεί να οδηγήσει σε συσσωμάτωση νανοϋλικών.Η συσσωμάτωση είναι ο σχηματισμός συσσωματωμάτων σωματιδίων διαφόρων σχημάτων και μεγεθών που συμβαίνει όταν τα διασκορπισμένα σωματίδια συναντώνται και οι τρέχουσες θερμοδυναμικές αλληλεπιδράσεις επιτρέπουν στα σωματίδια να προσκολληθούν μεταξύ τους.Ως εκ τούτου, οι σταθεροποιητές χρησιμοποιούνται για την πρόληψη της συσσωμάτωσης εισάγοντας μια αρκετά μεγάλη απωστική δύναμη μεταξύ των σωματιδίων για να εξουδετερωθεί η θερμοδυναμική έλξη τους.14
Αν και το θέμα του μεγέθους των σωματιδίων και της επιφανειακής κάλυψης έχει διερευνηθεί διεξοδικά στο πλαίσιο της ρύθμισης των βιολογικών δραστηριοτήτων που προκαλούνται από τα νανοσωματίδια, η συσσώρευση σωματιδίων είναι ένας τομέας που έχει παραμεληθεί σε μεγάλο βαθμό.Δεν υπάρχει σχεδόν καμία ενδελεχής μελέτη για την επίλυση της κολλοειδούς σταθερότητας των νανοσωματιδίων υπό βιολογικά σχετικές συνθήκες.10,15-17 Επιπλέον, αυτή η συνεισφορά είναι ιδιαίτερα σπάνια, όπου η τοξικότητα που σχετίζεται με τη συσσώρευση έχει επίσης μελετηθεί, ακόμη και αν μπορεί να προκαλέσει ανεπιθύμητες ενέργειες, όπως αγγειακή θρόμβωση ή απώλεια επιθυμητών χαρακτηριστικών, όπως η τοξικότητά της, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1.18, 19 φαίνεται.Στην πραγματικότητα, ένας από τους λίγους γνωστούς μηχανισμούς αντοχής στα νανοσωματίδια αργύρου σχετίζεται με τη συσσωμάτωση, επειδή ορισμένα στελέχη E. coli και Pseudomonas aeruginosa αναφέρεται ότι μειώνουν την ευαισθησία τους σε νανο-άργυρο εκφράζοντας την πρωτεΐνη μαστιγίνη, flagellin.Έχει υψηλή συγγένεια με το ασήμι, προκαλώντας έτσι συσσώρευση.20
Υπάρχουν αρκετοί διαφορετικοί μηχανισμοί που σχετίζονται με την τοξικότητα των νανοσωματιδίων αργύρου και η συσσώρευση επηρεάζει όλους αυτούς τους μηχανισμούς.Η πιο πολυσυζητημένη μέθοδος βιολογικής δραστηριότητας AgNP, που μερικές φορές αναφέρεται ως μηχανισμός «Δούρειος Ίππος», θεωρεί τα AgNP ως φορείς Ag+.1,21 Ο μηχανισμός δούρειου ίππου μπορεί να εξασφαλίσει μεγάλη αύξηση της τοπικής συγκέντρωσης Ag+, η οποία οδηγεί στη δημιουργία ROS και εκπόλωση της μεμβράνης.22-24 Η συσσωμάτωση μπορεί να επηρεάσει την απελευθέρωση Ag+, επηρεάζοντας έτσι την τοξικότητα, επειδή μειώνει την αποτελεσματική ενεργή επιφάνεια όπου τα ιόντα αργύρου μπορεί να οξειδωθούν και να διαλυθούν.Ωστόσο, τα AgNP δεν θα παρουσιάσουν τοξικότητα μόνο μέσω της απελευθέρωσης ιόντων.Πρέπει να ληφθούν υπόψη πολλές αλληλεπιδράσεις που σχετίζονται με το μέγεθος και τη μορφολογία.Μεταξύ αυτών, το μέγεθος και το σχήμα της επιφάνειας των νανοσωματιδίων είναι τα καθοριστικά χαρακτηριστικά.4,25 Η συλλογή αυτών των μηχανισμών μπορεί να κατηγοριοποιηθεί ως «μηχανισμοί επαγόμενης τοξικότητας».Υπάρχουν δυνητικά πολλές μιτοχονδριακές και επιφανειακές αντιδράσεις μεμβράνης που μπορούν να βλάψουν τα οργανίδια και να προκαλέσουν κυτταρικό θάνατο.25-27 Δεδομένου ότι ο σχηματισμός αδρανών επηρεάζει φυσικά το μέγεθος και το σχήμα των αντικειμένων που περιέχουν ασήμι και αναγνωρίζονται από ζωντανά συστήματα, αυτές οι αλληλεπιδράσεις μπορεί επίσης να επηρεαστούν.
Στην προηγούμενη εργασία μας σχετικά με τη συσσωμάτωση νανοσωματιδίων αργύρου, δείξαμε μια αποτελεσματική διαδικασία διαλογής που αποτελείται από χημικά και in vitro βιολογικά πειράματα για τη μελέτη αυτού του προβλήματος.19 Η δυναμική σκέδαση φωτός (DLS) είναι η προτιμώμενη τεχνική για αυτούς τους τύπους επιθεωρήσεων, επειδή το υλικό μπορεί να διασκορπίσει φωτόνια σε μήκος κύματος συγκρίσιμο με το μέγεθος των σωματιδίων του.Εφόσον η ταχύτητα κίνησης Brown των σωματιδίων στο υγρό μέσο σχετίζεται με το μέγεθος, η αλλαγή στην ένταση του σκεδαζόμενου φωτός μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της μέσης υδροδυναμικής διαμέτρου (Ζ-μέσος όρος) του υγρού δείγματος.28 Επιπλέον, εφαρμόζοντας μια τάση στο δείγμα, το δυναμικό ζήτα (δυναμικό ζ) του νανοσωματιδίου μπορεί να μετρηθεί παρόμοια με τη μέση τιμή Z.13,28 Εάν η απόλυτη τιμή του δυναμικού ζήτα είναι αρκετά υψηλή (σύμφωνα με γενικές οδηγίες> ±30 mV), θα δημιουργήσει ισχυρή ηλεκτροστατική απώθηση μεταξύ των σωματιδίων για να εξουδετερώσει τη συσσωμάτωση.Ο χαρακτηριστικός συντονισμός επιφανειακών πλασμονίων (SPR) είναι ένα μοναδικό οπτικό φαινόμενο, που αποδίδεται κυρίως σε νανοσωματίδια πολύτιμων μετάλλων (κυρίως Au και Ag).29​​Με βάση τις ηλεκτρονικές ταλαντώσεις (επιφανειακά πλασμόνια) αυτών των υλικών στη νανοκλίμακα, είναι γνωστό ότι τα σφαιρικά AgNPs έχουν χαρακτηριστική κορυφή απορρόφησης UV-Vis κοντά στα 400 nm.30 Η μετατόπιση της έντασης και του μήκους κύματος των σωματιδίων χρησιμοποιούνται για τη συμπλήρωση των αποτελεσμάτων DLS, καθώς αυτή η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση της συσσωμάτωσης νανοσωματιδίων και της επιφανειακής προσρόφησης βιομορίων.
Με βάση τις πληροφορίες που λήφθηκαν, οι δοκιμές βιωσιμότητας κυττάρων (MTT) και αντιβακτηριδιακών δοκιμών εκτελούνται με τρόπο κατά τον οποίο η τοξικότητα AgNP περιγράφεται ως συνάρτηση του επιπέδου συσσωμάτωσης και όχι ως (ο πιο συχνά χρησιμοποιούμενος παράγοντας) συγκέντρωσης νανοσωματιδίων.Αυτή η μοναδική μέθοδος μας επιτρέπει να δείξουμε τη βαθιά σημασία του επιπέδου συσσωμάτωσης στη βιολογική δραστηριότητα, επειδή, για παράδειγμα, τα AgNP με τερματισμό κιτρικού χάνουν εντελώς τη βιολογική τους δράση μέσα σε λίγες ώρες λόγω συσσωμάτωσης.19
Στην τρέχουσα εργασία, στοχεύουμε να επεκτείνουμε σημαντικά τις προηγούμενες συνεισφορές μας στη σταθερότητα των βιο-σχετιζόμενων κολλοειδών και τον αντίκτυπό τους στη βιολογική δραστηριότητα, μελετώντας την επίδραση του μεγέθους των νανοσωματιδίων στη συσσωμάτωση νανοσωματιδίων.Αυτή είναι αναμφίβολα μια από τις μελέτες για τα νανοσωματίδια.Μια προοπτική υψηλότερου προφίλ και 31 Για τη διερεύνηση αυτού του ζητήματος, χρησιμοποιήθηκε μια μέθοδος ανάπτυξης με μεσολάβηση σπόρου για την παραγωγή AgNP με τερματισμό κιτρικού άλατος σε τρεις διαφορετικές περιοχές μεγεθών (10, 20 και 50 nm).6,32 ως μία από τις πιο κοινές μεθόδους.Για νανοϋλικά που χρησιμοποιούνται ευρέως και τακτικά σε ιατρικές εφαρμογές, επιλέγονται AgNP με τερματισμό κιτρικού άλατος διαφορετικών μεγεθών για να μελετηθεί η πιθανή εξάρτηση από το μέγεθος των βιολογικών ιδιοτήτων του νανοαργυρίου που σχετίζονται με τη συσσώρευση.Μετά τη σύνθεση AgNP διαφορετικών μεγεθών, χαρακτηρίσαμε τα παραγόμενα δείγματα με ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης (TEM) και στη συνέχεια εξετάσαμε τα σωματίδια χρησιμοποιώντας την προαναφερθείσα διαδικασία διαλογής.Επιπλέον, παρουσία in vitro κυτταροκαλλιεργειών Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) και Εμβρυϊκού Βοείου Ορού (FBS), η εξαρτώμενη από το μέγεθος συμπεριφορά συσσωμάτωσης και η συμπεριφορά της αξιολογήθηκαν σε διάφορες τιμές pH, συγκεντρώσεις NaCl, γλυκόζης και γλουταμίνης.Τα χαρακτηριστικά της κυτταροτοξικότητας προσδιορίζονται υπό ολοκληρωμένες συνθήκες.Η επιστημονική συναίνεση δείχνει ότι γενικά, τα μικρότερα σωματίδια είναι προτιμότερα.Η έρευνά μας παρέχει μια χημική και βιολογική πλατφόρμα για να προσδιορίσουμε αν αυτό συμβαίνει.
Τρία νανοσωματίδια αργύρου με διαφορετικά εύρη μεγεθών παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο ανάπτυξης με μεσολάβηση σπόρου που προτείνεται από τους Wan et al., με μικρές προσαρμογές.6 Αυτή η μέθοδος βασίζεται στη χημική αναγωγή, χρησιμοποιώντας νιτρικό άργυρο (AgNO3) ως πηγή αργύρου, βοροϋδρίδιο του νατρίου (NaBH4) ως αναγωγικό παράγοντα και κιτρικό νάτριο ως σταθεροποιητή.Αρχικά, παρασκευάστε 75 mL υδατικού διαλύματος κιτρικού 9 mM από διένυδρο κιτρικό νάτριο (Na3C6H5O7 x 2H2O) και θερμάνετε στους 70°C.Στη συνέχεια, 2 mL διαλύματος AgNO3 1% β/ο προστέθηκαν στο μέσο αντίδρασης και στη συνέχεια το πρόσφατα παρασκευασμένο διάλυμα βοριοϋδριδίου του νατρίου (2 mL 0,1% β/ο) χύθηκε στο μίγμα στάγδην.Το προκύπτον κιτρινο-καφέ εναιώρημα διατηρήθηκε στους 70°C με έντονη ανάδευση για 1 ώρα, και στη συνέχεια ψύχθηκε σε θερμοκρασία δωματίου.Το δείγμα που προκύπτει (στο εξής θα αναφέρεται ως AgNP-I) χρησιμοποιείται ως βάση για την ανάπτυξη που προκαλείται από σπόρους στο επόμενο στάδιο σύνθεσης.
Για να συνθέσετε ένα μεσαίου μεγέθους εναιώρημα σωματιδίων (σημειώνεται ως AgNP-II), θερμάνετε 90 mL κιτρικού διαλύματος 7,6 mM στους 80°C, ανακατέψτε το με 10 mL AgNP-I και στη συνέχεια αναμείξτε 2 mL 1% w/v Το διάλυμα AgNO3 διατηρήθηκε υπό έντονη μηχανική ανάδευση για 1 ώρα, και στη συνέχεια το δείγμα ψύχθηκε σε θερμοκρασία δωματίου.
Για το μεγαλύτερο σωματίδιο (AgNP-III), επαναλάβετε την ίδια διαδικασία ανάπτυξης, αλλά σε αυτήν την περίπτωση, χρησιμοποιήστε 10 mL AgNP-II ως εναιώρημα σπόρων.Αφού τα δείγματα φτάσουν σε θερμοκρασία δωματίου, ορίζουν την ονομαστική τους συγκέντρωση Ag με βάση τη συνολική περιεκτικότητα σε AgNO3 στα 150 ppm προσθέτοντας ή εξατμίζοντας επιπλέον διαλύτη στους 40°C και τελικά τα αποθηκεύουν στους 4°C μέχρι περαιτέρω χρήση.
Χρησιμοποιήστε FEI Tecnai G2 20 X-Twin Transmission Electron Microscope (TEM) (FEI Corporate Headquarters, Hillsboro, Oregon, USA) με τάση επιτάχυνσης 200 kV για να εξετάσετε τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των νανοσωματιδίων και να συλλάβετε το μοτίβο περίθλασης ηλεκτρονίων (ED).Τουλάχιστον 15 αντιπροσωπευτικές εικόνες (~750 σωματίδια) αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού ImageJ και τα ιστογράμματα που προέκυψαν (και όλα τα γραφήματα σε ολόκληρη τη μελέτη) δημιουργήθηκαν στο OriginPro 2018 (OriginLab, Northampton, MA, ΗΠΑ) 33, 34.
Η μέση υδροδυναμική διάμετρος (μέσος όρος Ζ), το δυναμικό ζήτα (ζ-δυναμικό) και ο χαρακτηριστικός συντονισμός πλασμονίου επιφάνειας (SPR) των δειγμάτων μετρήθηκαν για να απεικονιστούν οι αρχικές κολλοειδείς ιδιότητές τους.Η μέση υδροδυναμική διάμετρος και το δυναμικό ζήτα του δείγματος μετρήθηκαν με το όργανο Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK) χρησιμοποιώντας διπλωμένα τριχοειδή κύτταρα μιας χρήσης στους 37±0,1°C.Ο Ocean Optics 355 DH-2000-BAL UV-Vis φασματοφωτόμετρο (Halma PLC, Largo, FL, USA) χρησιμοποιήθηκε για τη λήψη χαρακτηριστικών χαρακτηριστικών SPR από τα φάσματα απορρόφησης UV-Vis των δειγμάτων στην περιοχή των 250-800 nm.
Κατά τη διάρκεια ολόκληρου του πειράματος, πραγματοποιήθηκαν ταυτόχρονα τρεις διαφορετικοί τύποι μετρήσεων που σχετίζονται με την κολλοειδή σταθερότητα.Χρησιμοποιήστε το DLS για να μετρήσετε τη μέση υδροδυναμική διάμετρο (μέσος όρος Ζ) και το δυναμικό ζήτα (δυναμικό ζ) των σωματιδίων, επειδή ο μέσος όρος Ζ σχετίζεται με το μέσο μέγεθος των συσσωματωμάτων νανοσωματιδίων και το δυναμικό ζήτα υποδεικνύει εάν η ηλεκτροστατική απώθηση στο σύστημα είναι αρκετά ισχυρό για να αντισταθμίσει την έλξη Van der Waals μεταξύ των νανοσωματιδίων.Οι μετρήσεις γίνονται εις τριπλούν και η τυπική απόκλιση του μέσου όρου Ζ και του δυναμικού ζήτα υπολογίζεται από το λογισμικό Zetasizer.Τα χαρακτηριστικά φάσματα SPR των σωματιδίων αξιολογούνται με φασματοσκοπία UV-Vis, επειδή οι αλλαγές στην ένταση και το μήκος κύματος κορυφής μπορούν να υποδεικνύουν συσσωμάτωση και επιφανειακές αλληλεπιδράσεις.29,35 Στην πραγματικότητα, ο συντονισμός του επιφανειακού πλασμονίου σε πολύτιμα μέταλλα έχει τόσο μεγάλη επιρροή που έχει οδηγήσει σε νέες μεθόδους ανάλυσης βιομορίων.29,36,37 Η συγκέντρωση των AgNPs στο πειραματικό μείγμα είναι περίπου 10 ppm και ο σκοπός είναι να τεθεί η ένταση της μέγιστης αρχικής απορρόφησης SPR στο 1. Το πείραμα διεξήχθη με τρόπο εξαρτώμενο από το χρόνο στο 0.1,5;3;6;12 και 24 ώρες υπό διάφορες βιολογικά σχετικές συνθήκες.Περισσότερες λεπτομέρειες για την περιγραφή του πειράματος μπορείτε να δείτε στην προηγούμενη εργασία μας.19 Εν ολίγοις, διάφορες τιμές pH (3, 5, 7,2 και 9), διαφορετική συγκέντρωση χλωριούχου νατρίου (10 mM, 50 mM, 150 mM), γλυκόζης (3,9 mM, 6,7 mM) και γλουταμίνης (4 mM) και Επίσης, ετοίμασε το Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) και το Fetal Bovine Serum (FBS) (σε νερό και DMEM) ως μοντέλα συστημάτων και μελέτησε τις επιδράσεις τους στη συμπεριφορά συσσωμάτωσης των συντιθέμενων νανοσωματιδίων αργύρου.pH Οι τιμές του NaCl, της γλυκόζης και της γλουταμίνης αξιολογούνται με βάση τις φυσιολογικές συγκεντρώσεις, ενώ οι ποσότητες DMEM και FBS είναι ίδιες με τα επίπεδα που χρησιμοποιούνται σε ολόκληρο το πείραμα in vitro.38-42 Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν σε pH 7,2 και 37°C με σταθερή συγκέντρωση άλατος υποβάθρου 10 mM NaCl για την εξάλειψη τυχόν αλληλεπιδράσεων σωματιδίων σε μεγάλες αποστάσεις (εκτός από ορισμένα πειράματα που σχετίζονται με το pH και το NaCl, όπου αυτά τα χαρακτηριστικά είναι οι μεταβλητές κάτω από μελέτη).28 Ο κατάλογος των διαφόρων συνθηκών συνοψίζεται στον Πίνακα 1. Το πείραμα που σημειώνεται με † χρησιμοποιείται ως αναφορά και αντιστοιχεί σε δείγμα που περιέχει 10 mM NaCl και pH 7,2.
Ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη (DU145) και αθανατοποιημένα ανθρώπινα κερατινοκύτταρα (HaCaT) ελήφθησαν από την ATCC (Manassas, VA, USA).Τα κύτταρα καλλιεργούνται τακτικά στο ελάχιστο απαραίτητο μέσο Eagle (DMEM) της Dulbecco που περιέχει 4,5 g/L γλυκόζη (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, ΗΠΑ), συμπληρωμένο με 10% FBS, 2 mM L-γλουταμίνη, 0,01% στρεπτομυκίνη και 0,00% Πενικιλλίνη (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA).Τα κύτταρα καλλιεργούνται σε επωαστήρα 37°C υπό 5% CO2 και 95% υγρασία.
Προκειμένου να διερευνηθούν οι αλλαγές στην κυτταροτοξικότητα του AgNP που προκαλείται από τη συσσωμάτωση σωματιδίων με τρόπο εξαρτώμενο από το χρόνο, πραγματοποιήθηκε ένας προσδιορισμός ΜΤΤ δύο σταδίων.Πρώτον, μετρήθηκε η βιωσιμότητα των δύο τύπων κυττάρων μετά από θεραπεία με AgNP-I, AgNP-II και AgNP-III.Για το σκοπό αυτό, οι δύο τύποι κυττάρων σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 10.000 κυττάρων/φρεάτιο και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τρία διαφορετικά μεγέθη νανοσωματιδίων αργύρου σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις τη δεύτερη ημέρα.Μετά από 24 ώρες επεξεργασίας, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με 0,5 mg/mL αντιδραστηρίου ΜΤΤ (SERVA, Heidelberg, Γερμανία) αραιωμένο σε μέσο καλλιέργειας για 1 ώρα στους 37°C.Οι κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν σε DMSO (Sigma-Aldrich, Saint Louis, ΜΟ, ΗΠΑ) και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης πλακών Synergy HTX (BioTek-Ουγγαρία, Βουδαπέστη, Ουγγαρία).Η τιμή απορρόφησης του μη επεξεργασμένου δείγματος ελέγχου θεωρείται ότι είναι 100% ποσοστό επιβίωσης.Εκτελέστε τουλάχιστον 3 πειράματα χρησιμοποιώντας τέσσερα ανεξάρτητα βιολογικά αντίγραφα.Το IC50 υπολογίζεται από μια καμπύλη απόκρισης δόσης με βάση τα αποτελέσματα ζωτικότητας.
Στη συνέχεια, στο δεύτερο στάδιο, επωάζοντας τα σωματίδια με 150 mM NaCl για διαφορετικές χρονικές περιόδους (0, 1,5, 3, 6, 12 και 24 ώρες) πριν από την κυτταρική επεξεργασία, παρήχθησαν διαφορετικές καταστάσεις συσσωμάτωσης νανοσωματιδίων αργύρου.Στη συνέχεια, διεξήχθη ο ίδιος προσδιορισμός ΜΤΤ όπως περιγράφηκε προηγουμένως για να αξιολογηθούν οι αλλαγές στη βιωσιμότητα των κυττάρων που επηρεάζονται από τη συσσωμάτωση σωματιδίων.Χρησιμοποιήστε το GraphPad Prism 7 για να αξιολογήσετε το τελικό αποτέλεσμα, υπολογίστε τη στατιστική σημασία του πειράματος με μη ζευγαρωμένο t-test και σημειώστε το επίπεδό του ως * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01), *** (p ≤ 0,001 ) Και **** (p ≤ 0,0001).
Τρία διαφορετικά μεγέθη νανοσωματιδίων αργύρου (AgNP-I, AgNP-II και AgNP-III) χρησιμοποιήθηκαν για την αντιβακτηριακή ευαισθησία στο Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM; Research Center for Pathogenic Fungi and Microbial Toxicology, Chiba University TestMCMC31) και το Bacillus (SZMC: Szeged Microbiology Collection) και Ε. coli SZMC 0582 σε μέσο RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Co.).Προκειμένου να αξιολογηθούν οι αλλαγές στην αντιβακτηριακή δράση που προκαλούνται από τη συσσώρευση σωματιδίων, αρχικά προσδιορίστηκε η ελάχιστη ανασταλτική τους συγκέντρωση (MIC) με μικροαραίωση σε μια πλάκα μικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων.Σε 50 μL τυποποιημένου κυτταρικού εναιωρήματος (5 × 104 κύτταρα/mL σε μέσο RPMI 1640), προσθέστε 50 μL εναιωρήματος νανοσωματιδίων αργύρου και αραιώστε σειριακά διπλάσια συγκέντρωση (στο προαναφερθέν μέσο, ​​το εύρος είναι 0 και 75 ppm, δηλαδή, το δείγμα ελέγχου περιέχει 50 μL κυτταρικού εναιωρήματος και 50 μL μέσου χωρίς νανοσωματίδια).Στη συνέχεια, η πλάκα επωάστηκε στους 30°C για 48 ώρες και η οπτική πυκνότητα της καλλιέργειας μετρήθηκε στα 620 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης πλακών SPECTROstar Nano (BMG LabTech, Offenburg, Γερμανία).Το πείραμα πραγματοποιήθηκε τρεις φορές εις τριπλούν.
Εκτός από το ότι χρησιμοποιήθηκαν 50 μL μεμονωμένων συσσωματωμένων δειγμάτων νανοσωματιδίων αυτή τη στιγμή, χρησιμοποιήθηκε η ίδια διαδικασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως για να εξεταστεί η επίδραση της συσσωμάτωσης στην αντιβακτηριακή δράση στα προαναφερθέντα στελέχη.Διαφορετικές καταστάσεις συσσωμάτωσης νανοσωματιδίων αργύρου παράγονται με επώαση των σωματιδίων με 150 mM NaCl για διαφορετικές χρονικές περιόδους (0, 1,5, 3, 6, 12 και 24 ώρες) πριν από την κυτταρική επεξεργασία.Ως έλεγχος ανάπτυξης χρησιμοποιήθηκε εναιώρημα συμπληρωμένο με 50 μL μέσου RPMI 1640, ενώ για τον έλεγχο της τοξικότητας χρησιμοποιήθηκε εναιώρημα με μη συσσωματωμένα νανοσωματίδια.Το πείραμα πραγματοποιήθηκε τρεις φορές εις τριπλούν.Χρησιμοποιήστε το GraphPad Prism 7 για να αξιολογήσετε ξανά το τελικό αποτέλεσμα, χρησιμοποιώντας την ίδια στατιστική ανάλυση με την ανάλυση MTT.
Το επίπεδο συσσωμάτωσης των μικρότερων σωματιδίων (AgNP-I) έχει χαρακτηριστεί και τα αποτελέσματα δημοσιεύτηκαν εν μέρει στην προηγούμενη εργασία μας, αλλά για καλύτερη σύγκριση, όλα τα σωματίδια εξετάστηκαν διεξοδικά.Τα πειραματικά δεδομένα συλλέγονται και συζητούνται στις επόμενες ενότητες.Τρία μεγέθη AgNP.19
Οι μετρήσεις που πραγματοποιήθηκαν από TEM, UV-Vis και DLS επαλήθευσαν την επιτυχή σύνθεση όλων των δειγμάτων AgNP (Εικόνα 2A-D).Σύμφωνα με την πρώτη σειρά του Σχήματος 2, το μικρότερο σωματίδιο (AgNP-I) δείχνει μια ομοιόμορφη σφαιρική μορφολογία με μέση διάμετρο περίπου 10 nm.Η μέθοδος ανάπτυξης με τη μεσολάβηση των σπόρων παρέχει επίσης τα AgNP-II και AgNP-III με διαφορετικά εύρη μεγεθών με μέσες διαμέτρους σωματιδίων περίπου 20 nm και 50 nm, αντίστοιχα.Σύμφωνα με την τυπική απόκλιση της κατανομής των σωματιδίων, τα μεγέθη των τριών δειγμάτων δεν αλληλοκαλύπτονται, κάτι που είναι σημαντικό για τη συγκριτική τους ανάλυση.Συγκρίνοντας τη μέση αναλογία διαστάσεων και την αναλογία λεπτότητας των προβολών 2D σωματιδίων που βασίζονται σε TEM, υποτίθεται ότι η σφαιρικότητα των σωματιδίων αξιολογείται από το πρόσθετο φίλτρου σχήματος του ImageJ (Εικόνα 2Ε).43 Σύμφωνα με την ανάλυση του σχήματος των σωματιδίων, η αναλογία διαστάσεων τους (μεγάλη πλευρά/κοντή πλευρά του μικρότερου οριοθετημένου ορθογωνίου) δεν επηρεάζεται από την ανάπτυξη σωματιδίων και η αναλογία λεπτότητάς τους (μετρούμενη περιοχή του αντίστοιχου τέλειου κύκλου/θεωρητική περιοχή ) σταδιακά μειώνεται.Αυτό έχει ως αποτέλεσμα όλο και περισσότερα πολυεδρικά σωματίδια, τα οποία θεωρητικά είναι τέλεια στρογγυλά, που αντιστοιχούν σε λόγο λεπτότητας 1.
Εικόνα 2 Εικόνα Ηλεκτρονικού μικροσκοπίου μετάδοσης (TEM) (A), μοτίβο περίθλασης ηλεκτρονίων (ED) (B), ιστόγραμμα κατανομής μεγέθους (C), χαρακτηριστικό φάσμα απορρόφησης φωτός ορατού υπεριώδους (UV-Vis) και μέσο κιτρικό υγρό -Τελικά νανοσωματίδια αργύρου με μηχανική διάμετρο (μέσος όρος Z), δυναμικό ζήτα, λόγο διαστάσεων και λόγο πάχους (Ε) έχουν τρεις διαφορετικές περιοχές μεγεθών: AgNP-I είναι 10 nm (επάνω σειρά), AgNP-II είναι 20 nm (μεσαία σειρά ), AgNP-III (κάτω σειρά) είναι 50 nm.
Αν και η κυκλική φύση της μεθόδου ανάπτυξης επηρέασε το σχήμα των σωματιδίων σε κάποιο βαθμό, με αποτέλεσμα τη μικρότερη σφαιρικότητα των μεγαλύτερων AgNPs, και τα τρία δείγματα παρέμειναν σχεδόν σφαιρικά.Επιπλέον, όπως φαίνεται στο σχέδιο περίθλασης ηλεκτρονίων στο Σχήμα 2Β, νανο Η κρυσταλλικότητα των σωματιδίων δεν επηρεάζεται.Ο εξέχων δακτύλιος περίθλασης - ο οποίος μπορεί να συσχετιστεί με τους δείκτες (111), (220), (200) και (311) Miller του αργύρου - είναι πολύ συνεπής με την επιστημονική βιβλιογραφία και τις προηγούμενες συνεισφορές μας.9, 19,44 Ο κατακερματισμός του δακτυλίου Debye-Scherrer των AgNP-II και AgNP-III οφείλεται στο γεγονός ότι η εικόνα ED λαμβάνεται με την ίδια μεγέθυνση, έτσι ώστε καθώς αυξάνεται το μέγεθος των σωματιδίων, ο αριθμός των περιθλασμένων σωματιδίων ανά Η μονάδα επιφάνειας αυξάνεται και μειώνεται.
Το μέγεθος και το σχήμα των νανοσωματιδίων είναι γνωστό ότι επηρεάζουν τη βιολογική δραστηριότητα.3,45 Η εξαρτώμενη από το σχήμα καταλυτική και βιολογική δραστηριότητα μπορεί να εξηγηθεί από το γεγονός ότι διαφορετικά σχήματα τείνουν να πολλαπλασιάζονται ορισμένες κρυσταλλικές όψεις (που έχουν διαφορετικούς δείκτες Miller) και αυτές οι κρυσταλλικές όψεις έχουν διαφορετικές δραστηριότητες.45,46 Δεδομένου ότι τα παρασκευασμένα σωματίδια παρέχουν παρόμοια αποτελέσματα ΕΔ που αντιστοιχούν σε πολύ παρόμοια χαρακτηριστικά κρυστάλλου, μπορεί να υποτεθεί ότι στα επόμενα πειράματά μας κολλοειδούς σταθερότητας και βιολογικής δραστηριότητας, τυχόν παρατηρούμενες διαφορές θα πρέπει να αποδοθούν στο μέγεθος των νανοσωματιδίων και όχι στις ιδιότητες που σχετίζονται με το σχήμα.
Τα αποτελέσματα UV-Vis που συνοψίζονται στο Σχήμα 2D τονίζουν περαιτέρω τη συντριπτική σφαιρική φύση του συντιθέμενου AgNP, επειδή οι κορυφές SPR και των τριών δειγμάτων είναι περίπου 400 nm, που είναι μια χαρακτηριστική τιμή των σφαιρικών νανοσωματιδίων αργύρου.29,30 Τα συλλαμβανόμενα φάσματα επιβεβαίωσαν επίσης την επιτυχή ανάπτυξη του νανοαργυρίου με τη μεσολάβηση των σπόρων.Καθώς το μέγεθος των σωματιδίων αυξάνεται, το μήκος κύματος που αντιστοιχεί στη μέγιστη απορρόφηση φωτός του AgNP-II-πιο εμφανή-Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, το AgNP-III βίωσε μια μετατόπιση προς το κόκκινο.6,29
Όσον αφορά την αρχική κολλοειδή σταθερότητα του συστήματος AgNP, χρησιμοποιήθηκε DLS για τη μέτρηση της μέσης υδροδυναμικής διαμέτρου και του δυναμικού ζήτα των σωματιδίων σε pH 7,2.Τα αποτελέσματα που απεικονίζονται στο Σχήμα 2Ε δείχνουν ότι το AgNP-III έχει υψηλότερη κολλοειδή σταθερότητα από το AgNP-I ή το AgNP-II, επειδή οι κοινές κατευθυντήριες γραμμές υποδεικνύουν ότι ένα απόλυτο δυναμικό ζήτα 30 mV είναι απαραίτητο για τη μακροπρόθεσμη κολλοειδή σταθερότητα. Αυτό το εύρημα υποστηρίζεται περαιτέρω όταν η μέση τιμή Z (που λαμβάνεται ως η μέση υδροδυναμική διάμετρος ελεύθερων και συσσωματωμένων σωματιδίων) συγκρίνεται με το μέγεθος του πρωτογενούς σωματιδίου που λαμβάνεται από το TEM, επειδή όσο πιο κοντά είναι οι δύο τιμές, τόσο πιο ήπιος είναι ο βαθμός συγκέντρωσης στο δείγμα.Στην πραγματικότητα, ο μέσος όρος Z του AgNP-I και του AgNP-II είναι λογικά υψηλότερος από το κύριο μέγεθος σωματιδίων που αξιολογήθηκε με TEM, επομένως σε σύγκριση με το AgNP-III, αυτά τα δείγματα προβλέπεται να είναι πιο πιθανό να συσσωματωθούν, όπου το εξαιρετικά αρνητικό δυναμικό ζήτα συνοδεύεται από ένα κοντινό μέγεθος Η μέση τιμή Z.
Η εξήγηση αυτού του φαινομένου μπορεί να είναι διπλή.Από τη μία πλευρά, η συγκέντρωση κιτρικών διατηρείται σε παρόμοιο επίπεδο σε όλα τα στάδια σύνθεσης, παρέχοντας σχετικά υψηλή ποσότητα φορτισμένων ομάδων επιφανειών για να αποτραπεί η μείωση της ειδικής επιφάνειας των αναπτυσσόμενων σωματιδίων.Ωστόσο, σύμφωνα με τους Levak et al., μικρά μόρια όπως το κιτρικό μπορούν εύκολα να ανταλλάσσονται από βιομόρια στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων.Σε αυτή την περίπτωση, η κολλοειδής σταθερότητα θα καθοριστεί από το στέμμα των βιομορίων που παράγονται.31 Επειδή αυτή η συμπεριφορά παρατηρήθηκε επίσης στις μετρήσεις συσσωμάτωσης (που θα συζητηθούν λεπτομερέστερα αργότερα), η κάλυψη με κιτρικό από μόνη της δεν μπορεί να εξηγήσει αυτό το φαινόμενο.
Από την άλλη πλευρά, το μέγεθος των σωματιδίων είναι αντιστρόφως ανάλογο με την τάση συσσωμάτωσης σε επίπεδο νανομέτρων.Αυτό υποστηρίζεται κυρίως από την παραδοσιακή μέθοδο Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO), όπου η σωματιδιακή έλξη περιγράφεται ως το άθροισμα των ελκτικών και απωστικών δυνάμεων μεταξύ των σωματιδίων.Σύμφωνα με τον He et al., η μέγιστη τιμή της καμπύλης ενέργειας DLVO μειώνεται με το μέγεθος των νανοσωματιδίων στα νανοσωματίδια αιματίτη, καθιστώντας ευκολότερη την επίτευξη της ελάχιστης πρωτογενούς ενέργειας, προάγοντας έτσι τη μη αναστρέψιμη συσσωμάτωση (συμπύκνωση).47 Ωστόσο, εικάζεται ότι υπάρχουν και άλλες πτυχές πέρα ​​από τους περιορισμούς της θεωρίας DLVO.Αν και η βαρύτητα van der Waals και η ηλεκτροστατική απώθηση διπλής στιβάδας είναι παρόμοια με την αύξηση του μεγέθους των σωματιδίων, μια ανασκόπηση των Hotze et al.προτείνει ότι έχει ισχυρότερη επίδραση στη συγκέντρωση από ό,τι επιτρέπει το DLVO.14 Πιστεύουν ότι η επιφανειακή καμπυλότητα των νανοσωματιδίων δεν μπορεί πλέον να εκτιμηθεί ως επίπεδη επιφάνεια, καθιστώντας τη μαθηματική εκτίμηση ανεφάρμοστη.Επιπλέον, καθώς μειώνεται το μέγεθος των σωματιδίων, το ποσοστό των ατόμων που υπάρχουν στην επιφάνεια γίνεται υψηλότερο, οδηγώντας σε ηλεκτρονική δομή και συμπεριφορά επιφανειακού φορτίου.Και αλλάζει η αντιδραστικότητα της επιφάνειας, που μπορεί να οδηγήσει σε μείωση του φορτίου στο ηλεκτρικό διπλό στρώμα και να προάγει τη συσσώρευση.
Κατά τη σύγκριση των αποτελεσμάτων DLS των AgNP-I, AgNP-II και AgNP-III στο Σχήμα 3, παρατηρήσαμε ότι και τα τρία δείγματα έδειξαν παρόμοια συσσωμάτωση που προκάλεσε το pH.Ένα έντονα όξινο περιβάλλον (pH 3) μετατοπίζει το δυναμικό ζήτα του δείγματος σε 0 mV, προκαλώντας τα σωματίδια να σχηματίσουν συσσωματώματα μεγέθους μικρού, ενώ το αλκαλικό pH μετατοπίζει το δυναμικό ζήτα του σε μεγαλύτερη αρνητική τιμή, όπου τα σωματίδια σχηματίζουν μικρότερα συσσωματώματα (pH 5 ).Και 7.2) ), ή να παραμείνουν εντελώς ασύνολο (pH 9).Παρατηρήθηκαν επίσης ορισμένες σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών δειγμάτων.Σε όλο το πείραμα, το AgNP-I αποδείχθηκε ότι είναι το πιο ευαίσθητο σε αλλαγές δυναμικού ζήτα που προκαλούνται από το pH, επειδή το δυναμικό ζήτα αυτών των σωματιδίων έχει μειωθεί σε pH 7,2 σε σύγκριση με pH 9, ενώ τα AgNP-II και AgNP-III έδειξαν μόνο Α σημαντική αλλαγή στο ζ είναι γύρω στο pH 3. Επιπλέον, το AgNP-II έδειξε πιο αργές αλλαγές και μέτριο δυναμικό ζήτα, ενώ το AgNP-III έδειξε την πιο ήπια συμπεριφορά από τα τρία, επειδή το σύστημα έδειξε την υψηλότερη απόλυτη τιμή ζήτα και αργή κίνηση τάσης, υποδεικνύοντας AgNP-III Πιο ανθεκτικό στη συσσωμάτωση που προκαλείται από το pH.Αυτά τα αποτελέσματα είναι συνεπή με τα αποτελέσματα μέτρησης της μέσης υδροδυναμικής διαμέτρου.Λαμβάνοντας υπόψη το μέγεθος των σωματιδίων των εκκινητών τους, το AgNP-I έδειξε σταθερή σταδιακή συσσωμάτωση σε όλες τις τιμές pH, πιθανότατα λόγω του υποβάθρου NaCl 10 mM, ενώ τα AgNP-II και AgNP-III έδειξαν σημαντική μόνο σε συγκέντρωση pH 3.Η πιο ενδιαφέρουσα διαφορά είναι ότι παρά το μεγάλο μέγεθος νανοσωματιδίων του, το AgNP-III σχηματίζει τα μικρότερα συσσωματώματα σε pH 3 σε 24 ώρες, αναδεικνύοντας τις αντισυσσωματωτικές του ιδιότητες.Διαιρώντας το μέσο Z των AgNPs σε pH 3 μετά από 24 ώρες με την τιμή του παρασκευασμένου δείγματος, μπορεί να παρατηρηθεί ότι τα σχετικά μεγέθη των αδρανών AgNP-I και AgNP-II έχουν αυξηθεί κατά 50 φορές, 42 φορές και 22 φορές. , αντίστοιχα.III.
Σχήμα 3 Τα αποτελέσματα δυναμικής σκέδασης φωτός του δείγματος νανοσωματιδίων αργύρου με τερματικό κιτρικό άλας με αυξανόμενο μέγεθος (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II και 50 nm: AgNP-III) εκφράζονται ως η μέση υδροδυναμική διάμετρος (μέσος όρος Z ) (δεξιά) Κάτω από διαφορετικές συνθήκες pH, το δυναμικό ζήτα (αριστερά) αλλάζει μέσα σε 24 ώρες.
Η παρατηρούμενη εξαρτώμενη από το pH συσσωμάτωση επηρέασε επίσης τον χαρακτηριστικό συντονισμό επιφανειακού πλασμονίου (SPR) των δειγμάτων AgNP, όπως αποδεικνύεται από τα φάσματα UV-Vis τους.Σύμφωνα με το Συμπληρωματικό Σχήμα S1, η συσσωμάτωση και των τριών εναιωρημάτων νανοσωματιδίων αργύρου ακολουθείται από μείωση της έντασης των κορυφών τους SPR και μέτρια μετατόπιση του κόκκινου.Η έκταση αυτών των αλλαγών ως συνάρτηση του pH είναι συνεπής με τον βαθμό συσσωμάτωσης που προβλέπεται από τα αποτελέσματα DLS, ωστόσο, έχουν παρατηρηθεί μερικές ενδιαφέρουσες τάσεις.Σε αντίθεση με τη διαίσθηση, αποδεικνύεται ότι το μεσαίου μεγέθους AgNP-II είναι το πιο ευαίσθητο στις αλλαγές SPR, ενώ τα άλλα δύο δείγματα είναι λιγότερο ευαίσθητα.Στην έρευνα SPR, τα 50 nm είναι το θεωρητικό όριο μεγέθους σωματιδίων, το οποίο χρησιμοποιείται για τη διάκριση των σωματιδίων με βάση τις διηλεκτρικές τους ιδιότητες.Σωματίδια μικρότερα από 50 nm (AgNP-I και AgNP-II) μπορούν να περιγραφούν ως απλά διηλεκτρικά δίπολα, ενώ τα σωματίδια που φθάνουν ή υπερβαίνουν αυτό το όριο (AgNP-III) έχουν πιο πολύπλοκες διηλεκτρικές ιδιότητες και ο συντονισμός τους Η ζώνη χωρίζεται σε πολυτροπικές αλλαγές .Στην περίπτωση δύο μικρότερων δειγμάτων σωματιδίων, τα AgNPs μπορούν να θεωρηθούν απλά δίπολα και το πλάσμα μπορεί εύκολα να επικαλύπτεται.Καθώς το μέγεθος των σωματιδίων αυξάνεται, αυτή η σύζευξη παράγει ουσιαστικά ένα μεγαλύτερο πλάσμα, το οποίο μπορεί να εξηγήσει την υψηλότερη ευαισθησία που παρατηρείται.29 Ωστόσο, για τα μεγαλύτερα σωματίδια, η εκτίμηση του απλού διπόλου δεν είναι έγκυρη όταν μπορεί να εμφανιστούν και άλλες καταστάσεις σύζευξης, γεγονός που μπορεί να εξηγήσει τη μειωμένη τάση του AgNP-III να υποδεικνύει φασματικές αλλαγές.29
Υπό τις πειραματικές μας συνθήκες, αποδεικνύεται ότι η τιμή του pH έχει βαθιά επίδραση στην κολλοειδή σταθερότητα των επικαλυμμένων με κιτρικό νανοσωματίδια αργύρου διαφόρων μεγεθών.Στα συστήματα αυτά, η σταθερότητα παρέχεται από τις αρνητικά φορτισμένες ομάδες -COO- στην επιφάνεια των AgNPs.Η καρβοξυλική λειτουργική ομάδα του κιτρικού ιόντος πρωτονιώνεται σε μεγάλο αριθμό ιόντων Η+, έτσι η παραγόμενη καρβοξυλική ομάδα δεν μπορεί πλέον να παρέχει ηλεκτροστατική απώθηση μεταξύ των σωματιδίων, όπως φαίνεται στην επάνω σειρά του Σχήματος 4. Σύμφωνα με την αρχή του Le Chatelier, AgNP Τα δείγματα συσσωματώνονται γρήγορα σε pH 3, αλλά σταδιακά γίνονται όλο και πιο σταθερά καθώς αυξάνεται το pH.
Σχήμα 4 Σχηματικός μηχανισμός επιφανειακής αλληλεπίδρασης που ορίζεται από τη συσσωμάτωση κάτω από διαφορετικό pH (επάνω σειρά), συγκέντρωση NaCl (μεσαία σειρά) και βιομόρια (κάτω σειρά).
Σύμφωνα με το Σχήμα 5, η κολλοειδής σταθερότητα σε εναιωρήματα AgNP διαφορετικών μεγεθών εξετάστηκε επίσης υπό αυξανόμενες συγκεντρώσεις άλατος.Με βάση το δυναμικό ζήτα, το αυξημένο μέγεθος νανοσωματιδίων σε αυτά τα συστήματα AgNP με τερματικά κιτρικά άλατα παρέχει και πάλι ενισχυμένη αντίσταση στις εξωτερικές επιδράσεις από το NaCl.Στο AgNP-I, 10 mM NaCl είναι επαρκή για να προκληθεί ήπια συσσωμάτωση και μια συγκέντρωση άλατος 50 mM παρέχει πολύ παρόμοια αποτελέσματα.Στα AgNP-II και AgNP-III, τα 10 mM NaCl δεν επηρεάζουν σημαντικά το δυναμικό ζήτα επειδή οι τιμές τους παραμένουν στο (AgNP-II) ή κάτω από (AgNP-III) -30 mV.Η αύξηση της συγκέντρωσης NaCl στα 50 mM και τελικά στα 150 mM NaCl είναι αρκετή για να μειωθεί σημαντικά η απόλυτη τιμή του δυναμικού ζήτα σε όλα τα δείγματα, αν και τα μεγαλύτερα σωματίδια διατηρούν περισσότερο αρνητικό φορτίο.Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με την αναμενόμενη μέση υδροδυναμική διάμετρο των AgNPs.οι μέσες γραμμές τάσης Z που μετρήθηκαν στα 10, 50 και 150 mM NaCl δείχνουν διαφορετικές, σταδιακά αυξανόμενες τιμές.Τέλος, συσσωματώματα μεγέθους μικρού ανιχνεύθηκαν και στα τρία πειράματα 150 mM.
Σχήμα 5 Τα αποτελέσματα δυναμικής σκέδασης φωτός του δείγματος νανοσωματιδίων αργύρου με τερματικό κιτρικό άλας με αυξανόμενο μέγεθος (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II και 50 nm: AgNP-III) εκφράζονται ως η μέση υδροδυναμική διάμετρος (μέσος όρος Z ) (δεξιά) και το δυναμικό ζήτα (αριστερά) αλλάζουν εντός 24 ωρών υπό διαφορετικές συγκεντρώσεις NaCl.
Τα αποτελέσματα UV-Vis στο Συμπληρωματικό Σχήμα S2 δείχνουν ότι το SPR των 50 και 150 mM NaCl και στα τρία δείγματα έχει μια στιγμιαία και σημαντική μείωση.Αυτό μπορεί να εξηγηθεί από το DLS, επειδή η συσσωμάτωση με βάση το NaCl συμβαίνει ταχύτερα από τα πειράματα που εξαρτώνται από το pH, γεγονός που εξηγείται από τη μεγάλη διαφορά μεταξύ των πρώιμων μετρήσεων (0, 1,5 και 3 ώρες).Επιπλέον, η αύξηση της συγκέντρωσης άλατος θα αυξήσει επίσης τη σχετική διαπερατότητα του πειραματικού μέσου, η οποία θα έχει μια βαθιά επίδραση στον συντονισμό του επιφανειακού πλασμονίου.29
Η επίδραση του NaCl συνοψίζεται στη μεσαία σειρά του Σχήματος 4. Γενικά, μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι η αύξηση της συγκέντρωσης του χλωριούχου νατρίου έχει παρόμοια επίδραση με την αύξηση της οξύτητας, επειδή τα ιόντα Na+ έχουν την τάση να συντονίζονται γύρω από τις καρβοξυλικές ομάδες. καταστέλλοντας τα αρνητικά δυναμικά ζήτα AgNPs.Επιπλέον, 150 mM NaCl παρήγαγαν συσσωματώματα μεγέθους μικρού και στα τρία δείγματα, υποδεικνύοντας ότι η συγκέντρωση φυσιολογικού ηλεκτρολύτη είναι επιζήμια για την κολλοειδή σταθερότητα των AgNPs με τερματισμό κιτρικού.Λαμβάνοντας υπόψη την κρίσιμη συγκέντρωση συμπύκνωσης (CCC) του NaCl σε παρόμοια συστήματα AgNP, αυτά τα αποτελέσματα μπορούν να τοποθετηθούν έξυπνα στη σχετική βιβλιογραφία.Οι Huynh et al.υπολόγισε ότι το CCC του NaCl για νανοσωματίδια αργύρου με τερματικά κιτρικά με μέση διάμετρο 71 nm ήταν 47,6 mM, ενώ οι El Badawy et al.παρατήρησε ότι το CCC των 10 nm AgNPs με επικάλυψη κιτρικού ήταν 70 mM.10,16 Επιπλέον, το σημαντικά υψηλό CCC περίπου 300 mM μετρήθηκε από τους He et al., γεγονός που έκανε τη μέθοδο σύνθεσής τους να είναι διαφορετική από την προαναφερθείσα δημοσίευση.48 Αν και η τρέχουσα συνεισφορά δεν στοχεύει σε μια ολοκληρωμένη ανάλυση αυτών των τιμών, επειδή οι πειραματικές μας συνθήκες αυξάνουν την πολυπλοκότητα ολόκληρης της μελέτης, η βιολογικά σχετική συγκέντρωση NaCl των 50 mM, ειδικά 150 mM NaCl, φαίνεται να είναι αρκετά υψηλή.Προκλήθηκε πήξη, που εξηγεί τις έντονες αλλαγές που ανιχνεύθηκαν.
Το επόμενο βήμα στο πείραμα πολυμερισμού είναι η χρήση απλών αλλά βιολογικά σχετικών μορίων για την προσομοίωση των αλληλεπιδράσεων νανοσωματιδίου-βιομορίου.Με βάση τα αποτελέσματα DLS (Εικόνες 6 και 7) και UV-Vis (Συμπληρωματικά Σχήματα S3 και S4), μπορούν να εξαχθούν ορισμένα γενικά συμπεράσματα.Υπό τις πειραματικές μας συνθήκες, τα μελετημένα μόρια γλυκόζης και γλουταμίνης δεν θα προκαλέσουν συσσωμάτωση σε κανένα σύστημα AgNP, επειδή η τάση Z-mean σχετίζεται στενά με την αντίστοιχη τιμή μέτρησης αναφοράς.Αν και η παρουσία τους δεν επηρεάζει τη συσσωμάτωση, τα πειραματικά αποτελέσματα δείχνουν ότι αυτά τα μόρια είναι μερικώς προσροφημένα στην επιφάνεια των AgNPs.Το πιο σημαντικό αποτέλεσμα που υποστηρίζει αυτή την άποψη είναι η παρατηρούμενη αλλαγή στην απορρόφηση φωτός.Αν και το AgNP-I δεν παρουσιάζει σημαντικές αλλαγές στο μήκος κύματος ή στην ένταση, μπορεί να παρατηρηθεί πιο καθαρά με τη μέτρηση μεγαλύτερων σωματιδίων, κάτι που πιθανότατα οφείλεται στη μεγαλύτερη οπτική ευαισθησία που αναφέρθηκε προηγουμένως.Ανεξάρτητα από τη συγκέντρωση, η γλυκόζη μπορεί να προκαλέσει μεγαλύτερη μετατόπιση του κόκκινου μετά από 1,5 ώρα σε σύγκριση με τη μέτρηση ελέγχου, η οποία είναι περίπου 40 nm στο AgNP-II και περίπου 10 nm στο AgNP-III, γεγονός που αποδεικνύει την εμφάνιση επιφανειακών αλληλεπιδράσεων .Η γλουταμίνη έδειξε παρόμοια τάση, αλλά η αλλαγή δεν ήταν τόσο εμφανής.Επιπλέον, αξίζει επίσης να αναφέρουμε ότι η γλουταμίνη μπορεί να μειώσει το απόλυτο δυναμικό ζήτα των μεσαίων και μεγάλων σωματιδίων.Ωστόσο, δεδομένου ότι αυτές οι αλλαγές ζήτα δεν φαίνεται να επηρεάζουν το επίπεδο συσσωμάτωσης, μπορεί να υποτεθεί ότι ακόμη και μικρά βιομόρια όπως η γλουταμίνη μπορούν να παρέχουν έναν ορισμένο βαθμό χωρικής απώθησης μεταξύ των σωματιδίων.
Σχήμα 6 Τα αποτελέσματα δυναμικής σκέδασης φωτός δειγμάτων νανοσωματιδίων αργύρου με τερματισμό κιτρικού με αυξανόμενο μέγεθος (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II και 50 nm: AgNP-III) εκφράζονται ως η μέση υδροδυναμική διάμετρος (μέσος όρος Z) (δεξιά) Υπό εξωτερικές συνθήκες διαφορετικών συγκεντρώσεων γλυκόζης, το δυναμικό ζήτα (αριστερά) αλλάζει μέσα σε 24 ώρες.
Σχήμα 7 Τα αποτελέσματα δυναμικής σκέδασης φωτός του δείγματος νανοσωματιδίων αργύρου με τερματικό κιτρικό άλας με αυξανόμενο μέγεθος (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II και 50 nm: AgNP-III) εκφράζονται ως η μέση υδροδυναμική διάμετρος (μέσος όρος Z ) (δεξιά) Με την παρουσία γλουταμίνης, το δυναμικό ζήτα (αριστερά) αλλάζει μέσα σε 24 ώρες.
Εν ολίγοις, μικρά βιομόρια όπως η γλυκόζη και η γλουταμίνη δεν επηρεάζουν την κολλοειδή σταθερότητα στη μετρούμενη συγκέντρωση: αν και επηρεάζουν το δυναμικό ζήτα και τα αποτελέσματα UV-Vis σε διάφορους βαθμούς, τα αποτελέσματα του μέσου όρου Z δεν είναι συνεπή.Αυτό δείχνει ότι η επιφανειακή προσρόφηση των μορίων αναστέλλει την ηλεκτροστατική απώθηση, αλλά ταυτόχρονα παρέχει σταθερότητα διαστάσεων.
Για να συνδέσουμε τα προηγούμενα αποτελέσματα με τα προηγούμενα αποτελέσματα και να προσομοιώσουμε τις βιολογικές συνθήκες πιο επιδέξια, επιλέξαμε μερικά από τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα συστατικά κυτταροκαλλιέργειας και τα χρησιμοποιήσαμε ως πειραματικές συνθήκες για τη μελέτη της σταθερότητας των κολλοειδών AgNP.Σε ολόκληρο το πείραμα in vitro, μια από τις πιο σημαντικές λειτουργίες του DMEM ως μέσου είναι να δημιουργήσει τις απαραίτητες οσμωτικές συνθήκες, αλλά από χημική άποψη, είναι ένα σύνθετο διάλυμα άλατος με συνολική ιοντική ισχύ παρόμοια με 150 mM NaCl. .40 Όσο για το FBS, είναι ένα σύνθετο μείγμα βιομορίων-κυρίως πρωτεϊνών-από την άποψη της επιφανειακής προσρόφησης, έχει κάποιες ομοιότητες με τα πειραματικά αποτελέσματα γλυκόζης και γλουταμίνης, παρά τη χημική σύνθεση και την ποικιλομορφία Το φύλο είναι πολύ πιο περίπλοκο.19 DLS και UV-Τα ορατά αποτελέσματα που φαίνονται στο Σχήμα 8 και στο Συμπληρωματικό Σχήμα S5, αντίστοιχα, μπορούν να εξηγηθούν εξετάζοντας τη χημική σύνθεση αυτών των υλικών και συσχετίζοντας τα με τις μετρήσεις στην προηγούμενη ενότητα.
Σχήμα 8 Τα αποτελέσματα δυναμικής σκέδασης φωτός του δείγματος νανοσωματιδίων αργύρου με τερματικό κιτρικό άλας με αυξανόμενο μέγεθος (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II και 50 nm: AgNP-III) εκφράζονται ως η μέση υδροδυναμική διάμετρος (μέσος όρος Z ) (δεξιά) Παρουσία συστατικών κυτταροκαλλιέργειας DMEM και FBS, το δυναμικό ζήτα (αριστερά) αλλάζει εντός 24 ωρών.
Η αραίωση των AgNP διαφορετικών μεγεθών σε DMEM έχει παρόμοια επίδραση στην κολλοειδή σταθερότητα με αυτή που παρατηρείται παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων NaCl.Η διασπορά του AgNP σε DMEM 50 v/v% έδειξε ότι ανιχνεύθηκε συσσωμάτωση μεγάλης κλίμακας με την αύξηση του δυναμικού ζήτα και της μέσης τιμής Z και την απότομη μείωση της έντασης SPR.Αξίζει να σημειωθεί ότι το μέγιστο μέγεθος αδρανών που προκαλείται από το DMEM μετά από 24 ώρες είναι αντιστρόφως ανάλογο με το μέγεθος των νανοσωματιδίων του εκκινητή.
Η αλληλεπίδραση μεταξύ FBS και AgNP είναι παρόμοια με αυτή που παρατηρείται παρουσία μικρότερων μορίων όπως η γλυκόζη και η γλουταμίνη, αλλά το αποτέλεσμα είναι ισχυρότερο.Ο μέσος όρος Ζ των σωματιδίων παραμένει ανεπηρέαστος, ενώ ανιχνεύεται αύξηση του δυναμικού ζήτα.Η κορυφή SPR έδειξε μια ελαφρά μετατόπιση του κόκκινου, αλλά ίσως πιο ενδιαφέρον είναι ότι η ένταση SPR δεν μειώθηκε τόσο σημαντικά όσο στη μέτρηση ελέγχου.Αυτά τα αποτελέσματα μπορούν να εξηγηθούν από την έμφυτη προσρόφηση μακρομορίων στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων (κάτω σειρά στο Σχήμα 4), η οποία τώρα γίνεται κατανοητή ως ο σχηματισμός βιομοριακού στέμματος στο σώμα.49