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¿Son siempre mejores las nanopartículas más pequeñas?Comprender los efectos biológicos de la agregación dependiente del tamaño de nanopartículas de plata en condiciones biológicamente relevantes.
Autores: Bélteky P, Rónavári A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Kónya Z
Péter Bélteky,1,* Andrea Rónavári,1,* Dalma Zakupszky,1 Eszter Boka,1 Nóra Igaz,2 Bettina Szerencsés,3 Ilona Pfeiffer,3 Csaba Vágvölgyi,3 Mónika Kiricsi de Química Ambiental, Hungría, Facultad de Ciencias e Informática de Hungría , Universidad de Szeged;2 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias e Información, Universidad de Szeged, Hungría;3 Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias e Información, Universidad de Szeged, Hungría;Grupo de Investigación de Química de Superficies y Cinética de Reacción 4MTA-SZTE, Szeged, Hungría* Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo.Comunicación: Zoltán Kónya Departamento de Química Aplicada y Ambiental, Facultad de Ciencias e Informática, Universidad de Szeged, Rerrich Square 1, Szeged, H-6720, Hungría Teléfono +36 62 544620 Correo electrónico [Protección de correo electrónico] Propósito: Las nanopartículas de plata (AgNP) son uno de los nanomateriales más estudiados, especialmente por sus aplicaciones biomédicas.Sin embargo, debido a la agregación de nanopartículas, su excelente citotoxicidad y actividad antibacteriana a menudo se ven comprometidas en medios biológicos.En este trabajo, se estudió el comportamiento de agregación y las actividades biológicas relacionadas de tres muestras diferentes de nanopartículas de plata terminadas en citrato con un diámetro promedio de 10, 20 y 50 nm.Método: Utilice un microscopio electrónico de transmisión para sintetizar y caracterizar nanopartículas, evaluar su comportamiento de agregación a varios valores de pH, concentraciones de NaCl, glucosa y glutamina mediante dispersión dinámica de luz y espectroscopia ultravioleta-visible.Además, en el medio de cultivo celular componentes como Dulbecco mejoran el comportamiento de agregación en Eagle Medium y Fetal Calf Serum.Resultados: Los resultados muestran que el pH ácido y el contenido fisiológico de electrolitos generalmente inducen agregación a escala micrométrica, que puede estar mediada por la formación de corona biomolecular.Vale la pena señalar que las partículas más grandes presentan una mayor resistencia a las influencias externas que sus contrapartes más pequeñas.Se realizaron pruebas antibacterianas y de citotoxicidad in vitro tratando células con agregados de nanopartículas en diferentes etapas de agregación.Conclusión: Nuestros resultados revelan una profunda correlación entre la estabilidad coloidal y la toxicidad de las AgNP, ya que la agregación extrema conduce a la pérdida completa de la actividad biológica.El mayor grado de antiagregación observado en partículas más grandes tiene un impacto significativo en la toxicidad in vitro, porque dichas muestras retienen más actividad antimicrobiana y de células de mamíferos.Estos hallazgos llevan a la conclusión de que, a pesar de la opinión generalizada en la literatura relevante, apuntar a las nanopartículas más pequeñas posibles puede no ser el mejor curso de acción.Palabras clave: crecimiento mediado por semillas, estabilidad coloidal, comportamiento de agregación dependiente del tamaño, toxicidad por daño de agregación
A medida que la demanda y la producción de nanomateriales siguen aumentando, se presta cada vez más atención a su bioseguridad o actividad biológica.Las nanopartículas de plata (AgNP) son uno de los representantes de esta clase de materiales más comúnmente sintetizados, investigados y utilizados debido a sus excelentes propiedades catalíticas, ópticas y biológicas.1 En general, se cree que las características únicas de los nanomateriales (incluidos los AgNP) se atribuyen principalmente a su gran superficie específica.Por lo tanto, el problema inevitable es que cualquier proceso que afecte esta característica clave, como el tamaño de las partículas, el recubrimiento de la superficie o la agregación, dañará gravemente las propiedades de las nanopartículas que son críticas para aplicaciones específicas.
Los efectos del tamaño de las partículas y los estabilizadores son temas que han sido relativamente bien documentados en la literatura.Por ejemplo, la opinión generalmente aceptada es que las nanopartículas más pequeñas son más tóxicas que las más grandes.2 De acuerdo con la literatura general, nuestros estudios previos han demostrado la actividad dependiente del tamaño de la nanoplata en células y microorganismos de mamíferos.3– 5 El recubrimiento de superficies es otro atributo que tiene una amplia influencia en las propiedades de los nanomateriales.Con sólo añadir o modificar estabilizadores en su superficie, un mismo nanomaterial puede tener propiedades físicas, químicas y biológicas completamente diferentes.La aplicación de agentes de protección se realiza con mayor frecuencia como parte de la síntesis de nanopartículas.Por ejemplo, una de las AgNP más relevantes en la investigación son las nanopartículas de plata terminadas en citrato, que se sintetizan reduciendo sales de plata en una solución estabilizadora seleccionada como medio de reacción.6 El citrato puede aprovechar fácilmente su bajo costo, disponibilidad, biocompatibilidad y fuerte afinidad por la plata, lo que puede reflejarse en varias interacciones propuestas, desde adsorción superficial reversible hasta interacciones iónicas.Moléculas pequeñas e iones poliatómicos cercanos a 7,8, como citratos, polímeros, polielectrolitos y agentes biológicos, también se utilizan comúnmente para estabilizar la nanoplata y realizar funcionalizaciones únicas en ella.9-12
Aunque la posibilidad de alterar la actividad de las nanopartículas mediante el recubrimiento superficial intencional es un área muy interesante, el papel principal de este recubrimiento superficial es insignificante, ya que proporciona estabilidad coloidal al sistema de nanopartículas.La gran superficie específica de los nanomateriales producirá una gran energía superficial, lo que dificulta la capacidad termodinámica del sistema para alcanzar su energía mínima.13 Sin una estabilización adecuada, esto puede conducir a la aglomeración de nanomateriales.La agregación es la formación de agregados de partículas de diversas formas y tamaños que ocurre cuando las partículas dispersas se encuentran y las interacciones termodinámicas actuales permiten que las partículas se adhieran entre sí.Por lo tanto, se utilizan estabilizadores para evitar la agregación introduciendo una fuerza repulsiva suficientemente grande entre las partículas para contrarrestar su atracción termodinámica.14
Aunque el tema del tamaño de las partículas y la cobertura de la superficie se ha explorado a fondo en el contexto de su regulación de las actividades biológicas desencadenadas por las nanopartículas, la agregación de partículas es un área en gran medida descuidada.Casi no existe un estudio exhaustivo para resolver la estabilidad coloidal de las nanopartículas en condiciones biológicamente relevantes.10,15-17 Además, esta contribución es particularmente rara, donde también se ha estudiado la toxicidad asociada a la agregación, incluso si puede provocar reacciones adversas, como trombosis vascular, o pérdida de características deseadas, como su toxicidad, como como se muestra en la Figura 1.18, 19.De hecho, uno de los pocos mecanismos conocidos de resistencia a las nanopartículas de plata está relacionado con la agregación, porque se informa que ciertas cepas de E. coli y Pseudomonas aeruginosa reducen su sensibilidad a las nanopartículas de plata al expresar la proteína flagelina.Tiene una alta afinidad por la plata, lo que induce la agregación.20
Existen varios mecanismos diferentes relacionados con la toxicidad de las nanopartículas de plata y la agregación afecta a todos estos mecanismos.El método más discutido de actividad biológica de AgNP, a veces denominado mecanismo del “caballo de Troya”, considera a las AgNP como portadores de Ag+.1,21 El mecanismo del caballo de Troya puede asegurar un gran aumento en la concentración local de Ag+, lo que conduce a la generación de ROS y la despolarización de la membrana.22-24 La agregación puede afectar la liberación de Ag+, afectando así la toxicidad, porque reduce la superficie activa efectiva donde los iones de plata pueden oxidarse y disolverse.Sin embargo, las AgNP no solo exhibirán toxicidad mediante la liberación de iones.Se deben considerar muchas interacciones relacionadas con el tamaño y la morfología.Entre ellas, el tamaño y la forma de la superficie de la nanopartícula son las características definitorias.4,25 El conjunto de estos mecanismos se puede clasificar como “mecanismos de toxicidad inducida”.Existen potencialmente muchas reacciones mitocondriales y de membrana superficial que pueden dañar los orgánulos y provocar la muerte celular.25-27 Dado que la formación de agregados afecta naturalmente el tamaño y la forma de los objetos que contienen plata reconocidos por los sistemas vivos, estas interacciones también pueden verse afectadas.
En nuestro artículo anterior sobre la agregación de nanopartículas de plata, demostramos un procedimiento de detección eficaz que consiste en experimentos químicos y biológicos in vitro para estudiar este problema.19 La dispersión dinámica de la luz (DLS) es la técnica preferida para este tipo de inspecciones porque el material puede dispersar fotones a una longitud de onda comparable al tamaño de sus partículas.Dado que la velocidad de movimiento browniano de las partículas en el medio líquido está relacionada con el tamaño, el cambio en la intensidad de la luz dispersada se puede utilizar para determinar el diámetro hidrodinámico promedio (media Z) de la muestra líquida.28 Además, al aplicar un voltaje a la muestra, el potencial zeta (potencial ζ) de la nanopartícula se puede medir de manera similar al valor promedio Z.13,28 Si el valor absoluto del potencial zeta es lo suficientemente alto (según pautas generales > ±30 mV), generará una fuerte repulsión electrostática entre las partículas para contrarrestar la agregación.La resonancia característica de plasmón superficial (SPR) es un fenómeno óptico único, atribuido principalmente a nanopartículas de metales preciosos (principalmente Au y Ag).29 Basado en las oscilaciones electrónicas (plasmones superficiales) de estos materiales a nanoescala, se sabe que las AgNP esféricas tienen un pico de absorción UV-Vis característico cerca de 400 nm.30 La intensidad y el cambio de longitud de onda de las partículas se utilizan para complementar los resultados de DLS, ya que este método se puede utilizar para detectar la agregación de nanopartículas y la adsorción superficial de biomoléculas.
Con base en la información obtenida, los ensayos de viabilidad celular (MTT) y antibacterianos se realizan de una manera en la que la toxicidad de AgNP se describe como una función del nivel de agregación, en lugar de la concentración de nanopartículas (el factor más comúnmente utilizado).Este método único nos permite demostrar la profunda importancia del nivel de agregación en la actividad biológica, porque, por ejemplo, las AgNP terminadas en citrato pierden completamente su actividad biológica en unas pocas horas debido a la agregación.19
En el trabajo actual, nuestro objetivo es ampliar en gran medida nuestras contribuciones anteriores sobre la estabilidad de los coloides biorelacionados y su impacto en la actividad biológica mediante el estudio del efecto del tamaño de las nanopartículas en la agregación de nanopartículas.Este es sin duda uno de los estudios de nanopartículas.Una perspectiva de mayor perfil y 31 Para investigar este tema, se utilizó un método de crecimiento mediado por semillas para producir AgNP terminadas en citrato en tres rangos de tamaño diferentes (10, 20 y 50 nm).6,32 como uno de los métodos más comunes.Para los nanomateriales que se utilizan amplia y habitualmente en aplicaciones médicas, se seleccionan AgNP terminadas en citrato de diferentes tamaños para estudiar la posible dependencia del tamaño de las propiedades biológicas de la nanoplata relacionadas con la agregación.Después de sintetizar AgNP de diferentes tamaños, caracterizamos las muestras producidas mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y luego examinamos las partículas mediante el procedimiento de detección antes mencionado.Además, en presencia de cultivos celulares in vitro, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y suero bovino fetal (FBS), se evaluó el comportamiento de agregación dependiente del tamaño y su comportamiento a varios valores de pH, concentraciones de NaCl, glucosa y glutamina.Las características de la citotoxicidad se determinan en condiciones integrales.El consenso científico indica que en general son preferibles las partículas más pequeñas;Nuestra investigación proporciona una plataforma química y biológica para determinar si este es el caso.
Se prepararon tres nanopartículas de plata con diferentes rangos de tamaño mediante el método de crecimiento mediado por semillas propuesto por Wan et al., con ligeros ajustes.6 Este método se basa en la reducción química, utilizando nitrato de plata (AgNO3) como fuente de plata, borohidruro de sodio (NaBH4) como agente reductor y citrato de sodio como estabilizador.En primer lugar, preparar 75 ml de solución acuosa de citrato de 9 mM a partir de citrato de sodio dihidrato (Na3C6H5O7 x 2H2O) y calentar a 70°C.Luego, se agregaron 2 ml de solución de AgNO3 al 1 % p/v al medio de reacción y luego se vertió gota a gota la solución de borohidruro de sodio recién preparada (2 ml al 0,1 % p/v) en la mezcla.La suspensión resultante de color amarillo-marrón se mantuvo a 70°C con agitación vigorosa durante 1 hora y luego se enfrió a temperatura ambiente.La muestra resultante (a partir de ahora denominada AgNP-I) se utiliza como base para el crecimiento mediado por semillas en el siguiente paso de síntesis.
Para sintetizar una suspensión de partículas de tamaño mediano (denominada AgNP-II), caliente 90 ml de solución de citrato 7,6 mM a 80 °C, mézclelo con 10 ml de AgNP-I y luego mezcle 2 ml de solución de AgNO3 al 1 % p/v. Se mantuvo bajo agitación mecánica vigorosa durante 1 hora y luego la muestra se enfrió a temperatura ambiente.
Para la partícula más grande (AgNP-III), repita el mismo proceso de crecimiento, pero en este caso, utilice 10 ml de AgNP-II como suspensión de semillas.Una vez que las muestras alcanzan la temperatura ambiente, establecen su concentración nominal de Ag en función del contenido total de AgNO3 en 150 ppm agregando o evaporando solvente adicional a 40 °C y finalmente las almacenan a 4 °C hasta su uso posterior.
Utilice el microscopio electrónico de transmisión (TEM) FEI Tecnai G2 20 X-Twin (sede corporativa de FEI, Hillsboro, Oregón, EE. UU.) con un voltaje de aceleración de 200 kV para examinar las características morfológicas de las nanopartículas y capturar su patrón de difracción de electrones (ED).Se evaluaron al menos 15 imágenes representativas (~750 partículas) utilizando el paquete de software ImageJ, y los histogramas resultantes (y todos los gráficos de todo el estudio) se crearon en OriginPro 2018 (OriginLab, Northampton, MA, EE. UU.) 33, 34.
Se midieron el diámetro hidrodinámico promedio (promedio Z), el potencial zeta (potencial ζ) y la resonancia de plasmón superficial característica (SPR) de las muestras para ilustrar sus propiedades coloidales iniciales.El diámetro hidrodinámico promedio y el potencial zeta de la muestra se midieron con el instrumento Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido) utilizando células capilares plegadas desechables a 37 ± 0,1 °C.Se utilizó el espectrofotómetro UV-Vis Ocean Optics 355 DH-2000-BAL (Halma PLC, Largo, FL, EE. UU.) para obtener características SPR características de los espectros de absorción UV-Vis de muestras en el rango de 250-800 nm.
Durante todo el experimento se llevaron a cabo al mismo tiempo tres tipos diferentes de mediciones relacionadas con la estabilidad coloidal.Utilice DLS para medir el diámetro hidrodinámico promedio (promedio Z) y el potencial zeta (potencial ζ) de las partículas, porque el promedio Z está relacionado con el tamaño promedio de los agregados de nanopartículas, y el potencial zeta indica si la repulsión electrostática en el sistema es lo suficientemente fuerte como para compensar la atracción de Van der Waals entre nanopartículas.Las mediciones se realizan por triplicado y el software Zetasizer calcula la desviación estándar de la media Z y el potencial zeta.Los espectros SPR característicos de las partículas se evalúan mediante espectroscopia UV-Vis, porque los cambios en la intensidad máxima y la longitud de onda pueden indicar agregación e interacciones superficiales.29,35 De hecho, la resonancia de plasmón superficial en metales preciosos es tan influyente que ha dado lugar a nuevos métodos de análisis de biomoléculas.29,36,37 La concentración de AgNP en la mezcla experimental es de aproximadamente 10 ppm y el propósito es establecer la intensidad de la absorción inicial máxima de SPR en 1. El experimento se llevó a cabo de manera dependiente del tiempo en 0;1,5;3;6;12 y 24 horas bajo diversas condiciones biológicamente relevantes.Se pueden ver más detalles que describen el experimento en nuestro trabajo anterior.19 En resumen, varios valores de pH (3; 5; 7,2 y 9), diferentes concentraciones de cloruro de sodio (10 mM; 50 mM; 150 mM), glucosa (3,9 mM; 6,7 mM) y glutamina (4 mM), y También preparó el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y el suero fetal bovino (FBS) (en agua y DMEM) como sistemas modelo, y estudió sus efectos sobre el comportamiento de agregación de las nanopartículas de plata sintetizadas.pH Los valores de NaCl, glucosa y glutamina se evalúan en función de concentraciones fisiológicas, mientras que las cantidades de DMEM y FBS son las mismas que los niveles utilizados en todo el experimento in vitro.38-42 Todas las mediciones se realizaron a pH 7,2 y 37 °C con una concentración de sal de fondo constante de NaCl 10 mM para eliminar cualquier interacción de partículas a larga distancia (excepto ciertos experimentos relacionados con el pH y el NaCl, donde estos atributos son las variables bajo estudiar).28 La lista de diversas condiciones se resume en la Tabla 1. El experimento marcado con † se utiliza como referencia y corresponde a una muestra que contiene NaCl 10 mM y pH 7,2.
La línea celular de cáncer de próstata humano (DU145) y los queratinocitos humanos inmortalizados (HaCaT) se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA, EE. UU.).Las células se cultivan de forma rutinaria en el medio esencial mínimo Eagle (DMEM) de Dulbecco que contiene 4,5 g/l de glucosa (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EE. UU.), suplementado con FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM, estreptomicina al 0,01 % y estreptomicina al 0,005 %. Penicilina (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU.).Las células se cultivan en una incubadora a 37°C con 5% de CO2 y 95% de humedad.
Para explorar los cambios en la citotoxicidad de AgNP causados ​​por la agregación de partículas de manera dependiente del tiempo, se realizó un ensayo MTT de dos pasos.Primero, se midió la viabilidad de los dos tipos de células después del tratamiento con AgNP-I, AgNP-II y AgNP-III.Para ello, los dos tipos de células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 10.000 células/pocillo y se trataron con tres tamaños diferentes de nanopartículas de plata en concentraciones crecientes el segundo día.Después de 24 horas de tratamiento, las células se lavaron con PBS y se incubaron con reactivo MTT 0,5 mg/ml (SERVA, Heidelberg, Alemania) diluido en medio de cultivo durante 1 hora a 37°C.Los cristales de formazán se disolvieron en DMSO (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EE. UU.) y la absorción se midió a 570 nm utilizando un lector de placas Synergy HTX (BioTek-Hungary, Budapest, Hungría).El valor de absorción de la muestra de control no tratada se considera una tasa de supervivencia del 100%.Realizar al menos 3 experimentos utilizando cuatro réplicas biológicas independientes.La IC50 se calcula a partir de una curva dosis-respuesta basada en los resultados de vitalidad.
Posteriormente, en el segundo paso, incubando las partículas con NaCl 150 mM durante diferentes períodos de tiempo (0, 1,5, 3, 6, 12 y 24 horas) antes del tratamiento celular, se produjeron diferentes estados de agregación de nanopartículas de plata.Posteriormente, se realizó el mismo ensayo MTT como se describió anteriormente para evaluar los cambios en la viabilidad celular afectados por la agregación de partículas.Utilice GraphPad Prism 7 para evaluar el resultado final, calcule la significancia estadística del experimento mediante la prueba t no pareada y marque su nivel como * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01), *** (p ≤ 0,001 ) Y **** (p ≤ 0,0001).
Se utilizaron tres tamaños diferentes de nanopartículas de plata (AgNP-I, AgNP-II y AgNP-III) para determinar la susceptibilidad antibacteriana a Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM; Centro de investigación de hongos patógenos y toxicología microbiana, Universidad de Chiba) y Bacillus Test megaterium SZMC 6031. (SZMC: Szeged Microbiology Collection) y E. coli SZMC 0582 en medio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Co.).Para evaluar los cambios en la actividad antibacteriana causados ​​por la agregación de partículas, en primer lugar se determinó su concentración mínima inhibitoria (CMI) mediante microdilución en una placa de microtitulación de 96 pocillos.A 50 μL de suspensión celular estandarizada (5 × 104 células/mL en medio RPMI 1640), agregar 50 μL de suspensión de nanopartículas de plata y diluir serialmente al doble de la concentración (en el medio antes mencionado, el rango es 0 y 75 ppm, es decir, la muestra de control contiene 50 μL de suspensión celular y 50 μL de medio sin nanopartículas).Posteriormente, la placa se incubó a 30 °C durante 48 horas y la densidad óptica del cultivo se midió a 620 nm utilizando un lector de placas SPECTROstar Nano (BMG LabTech, Offenburg, Alemania).El experimento se realizó tres veces por triplicado.
Excepto que en este momento se usaron 50 μL de muestras de nanopartículas agregadas individuales, se usó el mismo procedimiento descrito anteriormente para examinar el efecto de la agregación sobre la actividad antibacteriana en las cepas antes mencionadas.Se producen diferentes estados de agregación de nanopartículas de plata incubando las partículas con NaCl 150 mM durante diferentes períodos de tiempo (0, 1,5, 3, 6, 12 y 24 horas) antes del procesamiento celular.Como control de crecimiento se utilizó una suspensión suplementada con 50 μL de medio RPMI 1640, mientras que para controlar la toxicidad se utilizó una suspensión con nanopartículas no agregadas.El experimento se realizó tres veces por triplicado.Utilice GraphPad Prism 7 para evaluar el resultado final nuevamente, utilizando el mismo análisis estadístico que el análisis MTT.
Se caracterizó el nivel de agregación de las partículas más pequeñas (AgNP-I), y los resultados se publicaron parcialmente en nuestro trabajo anterior, pero para una mejor comparación, todas las partículas se examinaron minuciosamente.Los datos experimentales se recopilan y analizan en las siguientes secciones.Tres tamaños de AgNP.19
Las mediciones realizadas por TEM, UV-Vis y DLS verificaron la síntesis exitosa de todas las muestras de AgNP (Figura 2A-D).Según la primera fila de la Figura 2, la partícula más pequeña (AgNP-I) muestra una morfología esférica uniforme con un diámetro promedio de aproximadamente 10 nm.El método de crecimiento mediado por semillas también proporciona AgNP-II y AgNP-III con diferentes rangos de tamaño con diámetros de partícula promedio de aproximadamente 20 nm y 50 nm, respectivamente.Según la desviación estándar de la distribución de partículas, los tamaños de las tres muestras no se superponen, lo cual es importante para su análisis comparativo.Al comparar la relación de aspecto promedio y la relación de delgadez de las proyecciones 2D de partículas basadas en TEM, se supone que la esfericidad de las partículas se evalúa mediante el complemento de filtro de forma de ImageJ (Figura 2E).43 Según el análisis de la forma de las partículas, su relación de aspecto (lado grande/lado corto del rectángulo delimitador más pequeño) no se ve afectada por el crecimiento de las partículas, y su relación de delgadez (área medida del círculo perfecto correspondiente/área teórica ) disminuye gradualmente.Esto da como resultado cada vez más partículas poliédricas, que en teoría son perfectamente redondas, lo que corresponde a una proporción de delgadez de 1.
Figura 2 Imagen de microscopio electrónico de transmisión (TEM) (A), patrón de difracción de electrones (ED) (B), histograma de distribución de tamaño (C), espectro de absorción de luz ultravioleta-visible (UV-Vis) característico (D) y citrato fluido promedio. Las nanopartículas de plata terminadas con diámetro mecánico (promedio Z), potencial zeta, relación de aspecto y relación de espesor (E) tienen tres rangos de tamaño diferentes: AgNP-I es de 10 nm (fila superior), AgNP-II es de 20 nm (fila del medio). ), AgNP-III (fila inferior) es de 50 nm.
Aunque la naturaleza cíclica del método de crecimiento afectó la forma de las partículas hasta cierto punto, lo que resultó en una esfericidad más pequeña de las AgNP más grandes, las tres muestras permanecieron cuasi esféricas.Además, como se muestra en el patrón de difracción de electrones en la Figura 2B, la cristalinidad nano de las partículas no se ve afectada.El prominente anillo de difracción, que puede correlacionarse con los índices de Miller de la plata (111), (220), (200) y (311), es muy consistente con la literatura científica y nuestras contribuciones anteriores.9, 19,44 La fragmentación del anillo de Debye-Scherrer de AgNP-II y AgNP-III se debe a que la imagen ED se captura con el mismo aumento, por lo que a medida que aumenta el tamaño de partícula, el número de partículas difractadas por la unidad de área aumenta y disminuye.
Se sabe que el tamaño y la forma de las nanopartículas afectan la actividad biológica.3,45 La actividad catalítica y biológica dependiente de la forma puede explicarse por el hecho de que diferentes formas tienden a proliferar en ciertas caras de cristal (que tienen diferentes índices de Miller), y estas caras de cristal tienen diferentes actividades.45,46 Dado que las partículas preparadas proporcionan resultados de DE similares que corresponden a características cristalinas muy similares, se puede suponer que en nuestros experimentos posteriores de estabilidad coloidal y actividad biológica, cualquier diferencia observada debe atribuirse al tamaño de las nanopartículas, no a las propiedades relacionadas con la forma.
Los resultados de UV-Vis resumidos en la Figura 2D enfatizan aún más la abrumadora naturaleza esférica del AgNP sintetizado, porque los picos de SPR de las tres muestras están alrededor de 400 nm, que es un valor característico de las nanopartículas de plata esféricas.29,30 Los espectros capturados también confirmaron el crecimiento exitoso de la nanoplata mediado por semillas.A medida que aumenta el tamaño de las partículas, la longitud de onda correspondiente a la máxima absorción de luz de AgNP-II -más prominentemente- según la literatura, AgNP-III experimentó un corrimiento al rojo.6,29
Con respecto a la estabilidad coloidal inicial del sistema AgNP, se utilizó DLS para medir el diámetro hidrodinámico promedio y el potencial zeta de las partículas a pH 7,2.Los resultados representados en la Figura 2E muestran que AgNP-III tiene una mayor estabilidad coloidal que AgNP-I o AgNP-II, porque las pautas comunes indican que es necesario un potencial zeta de 30 mV absoluto para la estabilidad coloidal a largo plazo. Este hallazgo se respalda aún más cuando El valor promedio Z (obtenido como el diámetro hidrodinámico promedio de partículas libres y agregadas) se compara con el tamaño de partícula primaria obtenido por TEM, porque cuanto más cerca están los dos valores, más suave es el grado que se acumula en la muestra.De hecho, el promedio Z de AgNP-I y AgNP-II es razonablemente mayor que su tamaño de partícula principal evaluado por TEM, por lo que, en comparación con AgNP-III, se predice que es más probable que estas muestras se agreguen, donde el potencial zeta altamente negativo va acompañado de un tamaño cercano El valor promedio Z.
La explicación de este fenómeno puede ser doble.Por un lado, la concentración de citrato se mantiene en un nivel similar en todos los pasos de síntesis, proporcionando una cantidad relativamente alta de grupos superficiales cargados para evitar que disminuya el área superficial específica de las partículas en crecimiento.Sin embargo, según Levak et al., las moléculas pequeñas como el citrato pueden intercambiarse fácilmente por biomoléculas en la superficie de las nanopartículas.En este caso, la estabilidad coloidal vendrá determinada por la corona de las biomoléculas producidas.31 Debido a que este comportamiento también se observó en nuestras mediciones de agregación (que se analizan con más detalle más adelante), la limitación con citrato por sí sola no puede explicar este fenómeno.
Por otro lado, el tamaño de las partículas es inversamente proporcional a la tendencia de agregación a nivel nanométrico.Esto está respaldado principalmente por el método tradicional de Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO), donde la atracción de partículas se describe como la suma de fuerzas de atracción y repulsión entre partículas.Según He et al., el valor máximo de la curva de energía DLVO disminuye con el tamaño de las nanopartículas en las nanopartículas de hematita, lo que facilita alcanzar la energía primaria mínima, promoviendo así una agregación irreversible (condensación).47 Sin embargo, se especula que existen otros aspectos más allá de las limitaciones de la teoría DLVO.Aunque la gravedad de Van der Waals y la repulsión electrostática de doble capa son similares al aumentar el tamaño de las partículas, una revisión de Hotze et al.propone que tiene un efecto más fuerte sobre la agregación que el que permite DLVO.14 Creen que la curvatura de la superficie de las nanopartículas ya no se puede estimar como una superficie plana, lo que hace que la estimación matemática sea inaplicable.Además, a medida que disminuye el tamaño de las partículas, el porcentaje de átomos presentes en la superficie aumenta, lo que lleva a la estructura electrónica y al comportamiento de carga superficial.Y cambios en la reactividad de la superficie, que pueden provocar una disminución de la carga en la doble capa eléctrica y promover la agregación.
Al comparar los resultados de DLS de AgNP-I, AgNP-II y AgNP-III en la Figura 3, observamos que las tres muestras mostraron un pH similar que provocó la agregación.Un ambiente muy ácido (pH 3) cambia el potencial zeta de la muestra a 0 mV, lo que hace que las partículas formen agregados del tamaño de una micra, mientras que un pH alcalino cambia su potencial zeta a un valor negativo mayor, donde las partículas forman agregados más pequeños (pH 5 ).y 7,2)), o permanecer completamente desagregados (pH 9).También se observaron algunas diferencias importantes entre las diferentes muestras.A lo largo del experimento, AgNP-I demostró ser el más sensible a los cambios de potencial zeta inducidos por el pH, porque el potencial zeta de estas partículas se ha reducido a pH 7,2 en comparación con pH 9, mientras que AgNP-II y AgNP-III solo mostraron A Un cambio considerable en ζ es alrededor de pH 3. Además, AgNP-II mostró cambios más lentos y potencial zeta moderado, mientras que AgNP-III mostró el comportamiento más suave de los tres, porque el sistema mostró el valor zeta absoluto más alto y un movimiento de tendencia lento, lo que indica AgNP-III Más resistente a la agregación inducida por el pH.Estos resultados son consistentes con los resultados promedio de la medición del diámetro hidrodinámico.Considerando el tamaño de partícula de sus cebadores, AgNP-I mostró una agregación gradual constante en todos los valores de pH, muy probablemente debido al fondo de NaCl 10 mM, mientras que AgNP-II y AgNP-III solo mostraron una acumulación significativa a pH 3.La diferencia más interesante es que a pesar de su gran tamaño de nanopartículas, AgNP-III forma los agregados más pequeños a pH 3 en 24 horas, destacando sus propiedades antiagregantes.Al dividir el Z promedio de AgNP a pH 3 después de 24 horas por el valor de la muestra preparada, se puede observar que los tamaños relativos de agregados de AgNP-I y AgNP-II han aumentado 50 veces, 42 veces y 22 veces. , respectivamente.III.
Figura 3 Los resultados de dispersión dinámica de la luz de la muestra de nanopartículas de plata terminadas en citrato con tamaño creciente (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II y 50 nm: AgNP-III) se expresan como el diámetro hidrodinámico promedio (promedio Z). ) (derecha) En diferentes condiciones de pH, el potencial zeta (izquierda) cambia en 24 horas.
La agregación dependiente del pH observada también afectó la resonancia de plasmón superficial característica (SPR) de las muestras de AgNP, como lo demuestran sus espectros UV-Vis.Según la Figura complementaria S1, a la agregación de las tres suspensiones de nanopartículas de plata le sigue una reducción en la intensidad de sus picos SPR y un desplazamiento hacia el rojo moderado.El alcance de estos cambios en función del pH es consistente con el grado de agregación predicho por los resultados de DLS; sin embargo, se han observado algunas tendencias interesantes.Contrariamente a la intuición, resulta que el AgNP-II de tamaño mediano es el más sensible a los cambios de SPR, mientras que las otras dos muestras son menos sensibles.En la investigación de SPR, 50 nm es el límite teórico del tamaño de partícula, que se utiliza para distinguir las partículas en función de sus propiedades dieléctricas.Las partículas menores de 50 nm (AgNP-I y AgNP-II) pueden describirse como dipolos dieléctricos simples, mientras que las partículas que alcanzan o exceden este límite (AgNP-III) tienen propiedades dieléctricas más complejas y su resonancia se divide en cambios multimodales. .En el caso de dos muestras de partículas más pequeñas, las AgNP pueden considerarse dipolos simples y el plasma puede superponerse fácilmente.A medida que aumenta el tamaño de las partículas, este acoplamiento produce esencialmente un plasma más grande, lo que puede explicar la mayor sensibilidad observada.29 Sin embargo, para las partículas más grandes, la estimación dipolar simple no es válida cuando también pueden ocurrir otros estados de acoplamiento, lo que puede explicar la menor tendencia de AgNP-III a indicar cambios espectrales.29
En nuestras condiciones experimentales, se demuestra que el valor del pH tiene un profundo efecto sobre la estabilidad coloidal de nanopartículas de plata recubiertas de citrato de varios tamaños.En estos sistemas, la estabilidad la proporcionan los grupos -COO- cargados negativamente en la superficie de las AgNP.El grupo funcional carboxilato del ion citrato está protonado en una gran cantidad de iones H+, por lo que el grupo carboxilo generado ya no puede proporcionar repulsión electrostática entre las partículas, como se muestra en la fila superior de la Figura 4. Según el principio de Le Chatelier, AgNP Las muestras se agregan rápidamente a pH 3, pero gradualmente se vuelven más y más estables a medida que aumenta el pH.
Figura 4 Mecanismo esquemático de interacción superficial definido por agregación bajo diferentes pH (fila superior), concentración de NaCl (fila central) y biomoléculas (fila inferior).
Según la Figura 5, también se examinó la estabilidad coloidal en suspensiones de AgNP de diferentes tamaños en concentraciones de sal crecientes.Basado en el potencial zeta, el aumento del tamaño de las nanopartículas en estos sistemas AgNP terminados en citrato nuevamente proporciona una mayor resistencia a las influencias externas del NaCl.En AgNP-I, 10 mM de NaCl son suficientes para inducir una agregación leve y una concentración de sal de 50 mM proporciona resultados muy similares.En AgNP-II y AgNP-III, el NaCl 10 mM no afecta significativamente el potencial zeta porque sus valores permanecen en (AgNP-II) o por debajo de (AgNP-III) -30 mV.Aumentar la concentración de NaCl a 50 mM y finalmente a 150 mM de NaCl es suficiente para reducir significativamente el valor absoluto del potencial zeta en todas las muestras, aunque las partículas más grandes retienen más carga negativa.Estos resultados son consistentes con el diámetro hidrodinámico promedio esperado de las AgNP;las líneas de tendencia promedio Z medidas en NaCl de 10, 50 y 150 mM muestran valores diferentes que aumentan gradualmente.Finalmente, se detectaron agregados del tamaño de una micra en los tres experimentos de 150 mM.
Figura 5 Los resultados de dispersión dinámica de la luz de la muestra de nanopartículas de plata terminadas en citrato con tamaño creciente (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II y 50 nm: AgNP-III) se expresan como el diámetro hidrodinámico promedio (promedio Z). ) (derecha) y el potencial zeta (izquierda) cambian en 24 horas bajo diferentes concentraciones de NaCl.
Los resultados de UV-Vis en la Figura complementaria S2 muestran que la SPR de NaCl 50 y 150 mM en las tres muestras tiene una disminución instantánea y significativa.Esto puede explicarse mediante DLS, porque la agregación basada en NaCl ocurre más rápido que los experimentos dependientes del pH, lo que se explica por la gran diferencia entre las mediciones tempranas (0, 1,5 y 3 horas).Además, aumentar la concentración de sal también aumentará la permitividad relativa del medio experimental, lo que tendrá un efecto profundo en la resonancia del plasmón superficial.29
El efecto del NaCl se resume en la fila central de la Figura 4. En general, se puede concluir que aumentar la concentración de cloruro de sodio tiene un efecto similar al de aumentar la acidez, porque los iones Na+ tienden a coordinarse alrededor de los grupos carboxilato. supresión de AgNP de potencial zeta negativo.Además, NaCl 150 mM produjo agregados del tamaño de una micra en las tres muestras, lo que indica que la concentración fisiológica de electrolitos es perjudicial para la estabilidad coloidal de las AgNP terminadas en citrato.Al considerar la concentración crítica de condensación (CCC) de NaCl en sistemas AgNP similares, estos resultados pueden ubicarse inteligentemente en la literatura relevante.Huynh et al.calcularon que la CCC de NaCl para nanopartículas de plata terminadas en citrato con un diámetro promedio de 71 nm fue de 47,6 mM, mientras que El Badawy et al.observaron que la CCC de AgNP de 10 nm con recubrimiento de citrato era de 70 mM.10,16 Además, He et al. midieron la CCC significativamente alta de aproximadamente 300 mM, lo que provocó que su método de síntesis fuera diferente de la publicación mencionada anteriormente.48 Aunque la contribución actual no está dirigida a un análisis exhaustivo de estos valores, debido a que nuestras condiciones experimentales aumentan en la complejidad de todo el estudio, la concentración de NaCl biológicamente relevante de 50 mM, especialmente NaCl de 150 mM, parece ser bastante alta.Coagulación inducida, lo que explica los fuertes cambios detectados.
El siguiente paso en el experimento de polimerización es utilizar moléculas simples pero biológicamente relevantes para simular interacciones nanopartículas-biomoléculas.Con base en los resultados de DLS (Figuras 6 y 7) y UV-Vis (Figuras complementarias S3 y S4), se pueden afirmar algunas conclusiones generales.En nuestras condiciones experimentales, las moléculas estudiadas de glucosa y glutamina no inducirán agregación en ningún sistema AgNP, porque la tendencia de la media Z está estrechamente relacionada con el valor de medición de referencia correspondiente.Aunque su presencia no afecta la agregación, los resultados experimentales muestran que estas moléculas están parcialmente adsorbidas en la superficie de las AgNP.El resultado más destacado que respalda esta opinión es el cambio observado en la absorción de luz.Aunque AgNP-I no muestra cambios significativos en longitud de onda o intensidad, se puede observar más claramente midiendo partículas más grandes, lo que probablemente se debe a la mayor sensibilidad óptica mencionada anteriormente.Independientemente de la concentración, la glucosa puede provocar un mayor corrimiento al rojo después de 1,5 horas en comparación con la medición de control, que es de aproximadamente 40 nm en AgNP-II y aproximadamente 10 nm en AgNP-III, lo que demuestra la aparición de interacciones superficiales.La glutamina mostró una tendencia similar, pero el cambio no fue tan obvio.Además, también cabe mencionar que la glutamina puede reducir el potencial zeta absoluto de partículas medianas y grandes.Sin embargo, dado que estos cambios zeta no parecen afectar el nivel de agregación, se puede especular que incluso biomoléculas pequeñas como la glutamina pueden proporcionar un cierto grado de repulsión espacial entre partículas.
Figura 6 Los resultados de dispersión dinámica de la luz de muestras de nanopartículas de plata terminadas en citrato con tamaño creciente (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II y 50 nm: AgNP-III) se expresan como el diámetro hidrodinámico promedio (promedio Z) (derecha) En condiciones externas de diferentes concentraciones de glucosa, el potencial zeta (izquierda) cambia en 24 horas.
Figura 7 Los resultados de dispersión dinámica de la luz de la muestra de nanopartículas de plata terminadas en citrato con tamaño creciente (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II y 50 nm: AgNP-III) se expresan como el diámetro hidrodinámico promedio (promedio Z). ) (derecha) En presencia de glutamina, el potencial zeta (izquierda) cambia en 24 horas.
En resumen, las biomoléculas pequeñas como la glucosa y la glutamina no afectan la estabilidad coloidal en la concentración medida: aunque afectan el potencial zeta y los resultados UV-Vis en diversos grados, los resultados promedio Z no son consistentes.Esto indica que la adsorción superficial de moléculas inhibe la repulsión electrostática, pero al mismo tiempo proporciona estabilidad dimensional.
Para vincular los resultados anteriores con los resultados anteriores y simular las condiciones biológicas de manera más hábil, seleccionamos algunos de los componentes de cultivos celulares más utilizados y los usamos como condiciones experimentales para estudiar la estabilidad de los coloides AgNP.En todo el experimento in vitro, una de las funciones más importantes del DMEM como medio es establecer las condiciones osmóticas necesarias, pero desde el punto de vista químico, es una solución salina compleja con una fuerza iónica total similar al NaCl 150 mM. .40 En cuanto al FBS, es una mezcla compleja de biomoléculas, principalmente proteínas, desde el punto de vista de la adsorción superficial, tiene algunas similitudes con los resultados experimentales de la glucosa y la glutamina, a pesar de la composición química y la diversidad sexual es mucho más complicada.19 DLS y UV: los resultados visibles que se muestran en la Figura 8 y la Figura complementaria S5, respectivamente, se pueden explicar examinando la composición química de estos materiales y correlacionándolos con las mediciones de la sección anterior.
Figura 8 Los resultados de dispersión dinámica de la luz de la muestra de nanopartículas de plata terminadas en citrato con tamaño creciente (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II y 50 nm: AgNP-III) se expresan como el diámetro hidrodinámico promedio (promedio Z). ) (derecha) En presencia de los componentes del cultivo celular DMEM y FBS, el potencial zeta (izquierda) cambia en 24 horas.
La dilución de AgNP de diferentes tamaños en DMEM tiene un efecto similar sobre la estabilidad coloidal al observado en presencia de altas concentraciones de NaCl.La dispersión de AgNP en DMEM al 50 v/v% mostró que se detectó agregación a gran escala con el aumento del potencial zeta y el valor promedio Z y la fuerte disminución de la intensidad de SPR.Vale la pena señalar que el tamaño máximo de agregado inducido por DMEM después de 24 horas es inversamente proporcional al tamaño de las nanopartículas del cebador.
La interacción entre FBS y AgNP es similar a la observada en presencia de moléculas más pequeñas como la glucosa y la glutamina, pero el efecto es más fuerte.La media Z de las partículas no se ve afectada, mientras que se detecta un aumento del potencial zeta.El pico de SPR mostró un ligero desplazamiento hacia el rojo, pero quizás lo más interesante es que la intensidad de SPR no disminuyó tan significativamente como en la medición de control.Estos resultados pueden explicarse por la adsorción innata de macromoléculas en la superficie de las nanopartículas (fila inferior en la Figura 4), que ahora se entiende como la formación de una corona biomolecular en el cuerpo.49