Hõbeda nanoosakesi (AgNP) peetakse potentsiaalselt kasulikuks vahendiks erinevate patogeenide tõrjeks.Siiski on muret AgNP-de sattumine keskkonnakeskkonda, kuna need võivad avaldada kahjulikku mõju inimeste tervisele ja keskkonnale.Selles uuringus töötasime välja ja hindasime uudse mikromeetri suuruse magnetilise hübriidkolloidi (MHC), mis oli kaunistatud erineva suurusega AgNP-dega (AgNP-MHC).Pärast desinfitseerimist saab neid osakesi nende magnetilisi omadusi kasutades keskkonnakeskkonnast kergesti kätte saada ja need jäävad tõhusaks viiruspatogeenide inaktiveerimiseks.Hindasime AgNP-MHC-de efektiivsust bakteriofaagi ϕX174, hiire noroviiruse (MNV) ja adenoviiruse serotüübi 2 (AdV2) inaktiveerimiseks.Neid sihtviiruseid eksponeeriti AgNP-MHC-dele 1, 3 ja 6 tundi temperatuuril 25 °C ning seejärel analüüsiti naastude testi ja reaalajas TaqMan PCR-iga.AgNP-MHC-d puutusid kokku mitmesuguste pH-tasemete ning kraani- ja pinnaveega, et hinnata nende viirusevastast toimet erinevates keskkonnatingimustes.Kolmest testitud AgNP-MHC-tüübist näitasid Ag30-MHC-d viiruste inaktiveerimisel kõrgeimat efektiivsust.ϕX174 ja MNV vähenesid rohkem kui 2 log10 võrra pärast kokkupuudet 4,6 × 109 Ag30-MHC/ml 1 tunni jooksul.Need tulemused näitasid, et AgNP-MHC-sid saab kasutada viiruslike patogeenide inaktiveerimiseks minimaalse võimaliku keskkonda sattumise võimalusega.

Seoses viimaste edusammudega nanotehnoloogias on nanoosakesed pälvinud kogu maailmas biotehnoloogia, meditsiini ja rahvatervise valdkonnas suuremat tähelepanu.1,2).Tänu oma kõrgele pinna-mahu suhtele on nanosuurustel materjalidel, mis jäävad tavaliselt vahemikku 10–500 nm, ainulaadsed füüsikalis-keemilised omadused võrreldes suuremate materjalidega (1).Nanomaterjalide kuju ja suurust saab kontrollida ning nende pinnale saab konjugeerida spetsiifilisi funktsionaalseid rühmi, et võimaldada koostoimeid teatud valkudega või rakusisest omastamist (3,–5).

Hõbeda nanoosakesi (AgNP-sid) on antimikroobsete ainetena laialdaselt uuritud.6).Hõbedat kasutatakse peente söögiriistade valmistamisel, kaunistustes ja raviainetes.Hõbedaühendeid, nagu hõbesulfadiasiin ja teatud soolad, on nende antimikroobsete omaduste tõttu kasutatud haavahooldusvahenditena ja nakkushaiguste ravina.6,7).Hiljutised uuringud on näidanud, et AgNP-d on väga tõhusad erinevat tüüpi bakterite ja viiruste inaktiveerimiseks (8,–11).AgNP-dest vabanevad AgNP-d ja Ag+ ioonid interakteeruvad otseselt fosforit või väävlit sisaldavate biomolekulidega, sealhulgas DNA, RNA ja valkudega (12,–14).Samuti on näidatud, et need tekitavad reaktiivseid hapniku liike (ROS), põhjustades mikroorganismide membraanikahjustusi (15).AgNP-de suurus, kuju ja kontsentratsioon on samuti olulised tegurid, mis mõjutavad nende antimikroobset võimet.8,10,13,16,17).

Varasemad uuringud on toonud esile ka mitmeid probleeme, kui AgNP-sid kasutatakse patogeenide tõrjeks veekeskkonnas.Esiteks on olemasolevad uuringud AgNP-de tõhususe kohta viiruslike patogeenide inaktiveerimiseks vees piiratud.Lisaks sellele alluvad monodisperssed AgNP-d nende väikese suuruse ja suure pindala tõttu tavaliselt osakeste-osakeste agregatsioonile ning need agregaadid vähendavad AgNP-de efektiivsust mikroobsete patogeenide vastu (7).Lõpuks on näidatud, et AgNP-del on erinevad tsütotoksilised toimed (5,18,–20) ning AgNP-de sattumine veekeskkonda võib põhjustada inimeste tervise- ja ökoloogilisi probleeme.

Hiljuti töötasime välja uudse mikromeetri suuruse magnetilise hübriidkolloidi (MHC), mis on kaunistatud erineva suurusega AgNP-dega (21,22).MHC südamikku saab kasutada AgNP komposiitide taastamiseks keskkonnast.Hindasime nende hõbeda nanoosakeste viirusevastast efektiivsust MHC-dele (AgNP-MHC), kasutades bakteriofaagi ϕX174, hiire noroviirust (MNV) ja adenoviirust erinevates keskkonnatingimustes.

AgNP-MHC-de viirusevastane toime erinevates kontsentratsioonides bakteriofaagi ϕX174 (a), MNV (b) ja AdV2 (c) vastu.Sihtviiruseid töödeldi erineva kontsentratsiooniga AgNP-MHC-dega ja kontrollina OH-MHC-dega (4,6 × 109 osakest/ml) loksutamisinkubaatoris (150 pööret minutis, 1 tund, 25 °C).Ellujäänud viiruste mõõtmiseks kasutati naastude analüüsi meetodit.Väärtused on keskmised ± standardhälbed (SD) kolmest sõltumatust katsest.Tärnid tähistavad oluliselt erinevaid väärtusi (P< 0,05 ühesuunalise ANOVA abil Dunnetti testiga).

See uuring näitas, et AgNP-MHC-d on tõhusad bakteriofaagide ja inimese noroviiruse asendusaine MNV inaktiveerimiseks vees.Lisaks saab AgNP-MHC-sid magnetiga hõlpsasti taastada, vältides tõhusalt potentsiaalselt toksiliste AgNP-de vabanemist keskkonda.Mitmed varasemad uuringud on näidanud, et AgNP-de kontsentratsioon ja osakeste suurus on sihtmikroorganismide inaktiveerimisel kriitilised tegurid.8,16,17).AgNP-de antimikroobne toime sõltub ka mikroorganismi tüübist.AgNP-MHC-de efektiivsus ϕX174 inaktiveerimiseks järgis annuse-vastuse suhet.Testitud AgNP-MHC-de hulgas oli Ag30-MHC-del suurem efektiivsus ϕX174 ja MNV inaktiveerimiseks.MNV puhul näitasid ainult Ag30-MHC-d viirusevastast toimet, teised AgNP-MHC-d ei põhjustanud MNV olulist inaktiveerimist.Ühelgi AgNP-MHC-l ei olnud AdV2 vastu olulist viirusevastast toimet.

Lisaks osakeste suurusele oli oluline ka hõbeda kontsentratsioon AgNP-MHC-des.Näis, et hõbeda kontsentratsioon määras AgNP-MHC-de viirusevastase toime tõhususe.Hõbeda kontsentratsioonid Ag07-MHC ja Ag30-MHC lahustes 4,6 × 109 osakest/ml olid vastavalt 28,75 ppm ja 200 ppm ning korreleerusid viirusevastase toime tasemega.Tabel 2võtab kokku testitud AgNP-MHC-de hõbeda kontsentratsioonid ja pindalad.Ag07-MHC-del oli madalaim viirusevastane toime ja madalaim hõbeda kontsentratsioon ja pindala, mis viitab sellele, et need omadused on seotud AgNP-MHC-de viirusevastase toimega.

Meie eelmine uuring näitas, et AgNP-MHC-de peamised antimikroobsed mehhanismid on Mg2+ või Ca2+ ioonide keemiline eemaldamine mikroobsetest membraanidest, komplekside loomine membraanidel paiknevate tioolrühmadega ja reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tekitamine.21).Kuna AgNP-MHC-del on suhteliselt suur osakeste suurus (∼ 500 nm), on ebatõenäoline, et nad suudaksid tungida läbi viiruse kapsiidi.Selle asemel näivad AgNP-MHC-d interakteeruvat viiruse pinnavalkudega.Komposiitidel olevad AgNP-d kipuvad siduma tioolrühma sisaldavaid biomolekule, mis on sisestatud viiruste kattevalkudesse.Seetõttu on viiruse kapsiidivalkude biokeemilised omadused olulised nende tundlikkuse määramisel AgNP-MHC-de suhtes.Joonis 1näitab viiruste erinevat tundlikkust AgNP-MHC-de mõjude suhtes.Bakteriofaagid ϕX174 ja MNV olid AgNP-MHC suhtes vastuvõtlikud, kuid AdV2 oli resistentne.AdV2 kõrge takistuse tase on tõenäoliselt seotud selle suuruse ja struktuuriga.Adenoviiruste suurus on vahemikus 70 kuni 100 nm (30), muutes need palju suuremaks kui ϕX174 (27 kuni 33 nm) ja MNV (28 kuni 35 nm) (31,32).Lisaks suurele suurusele on adenoviirustel erinevalt teistest viirustest kaheahelaline DNA ja nad on vastupidavad erinevatele keskkonnamõjudele, nagu kuumus ja UV-kiirgus.33,34).Meie eelmine uuring teatas, et Ag30-MHC-dega vähenes MS2 peaaegu 3-log10 6 tunni jooksul (21).MS2 ja ϕX174 on erinevat tüüpi nukleiinhapetega (RNA või DNA) sarnase suurusega, kuid Ag30-MHC-de inaktiveerimise kiirus on sarnane.Seetõttu ei näi nukleiinhappe olemus olevat AgNP-MHC-de suhtes resistentsuse peamine tegur.Selle asemel tundus viiruseosakeste suurus ja kuju olulisem olevat, kuna adenoviirus on palju suurem viirus.Ag30-MHC-d saavutasid M13 vähenemise peaaegu 2-log10 6 tunni jooksul (meie avaldamata andmed).M13 on üheahelaline DNA viirus (35) ja selle pikkus on ~880 nm ja läbimõõt 6,6 nm (36).Filamentse bakteriofaagi M13 inaktiveerimise kiirus oli vahepealne väikeste ümara struktuuriga viiruste (MNV, ϕX174 ja MS2) ja suure viiruse (AdV2) omade vahel.

Käesolevas uuringus oli MNV inaktiveerimise kineetika naastude testis ja RT-PCR testis oluliselt erinev (Joonis 2bjajac).c).Teadaolevalt alahindavad molekulaarsed testid, nagu RT-PCR, viiruste inaktiveerimise määra märkimisväärselt.25,28), nagu leiti meie uuringust.Kuna AgNP-MHC-d interakteeruvad peamiselt viiruse pinnaga, kahjustavad nad tõenäolisemalt viiruse kattevalke, mitte viiruse nukleiinhappeid.Seetõttu võib viiruse nukleiinhappe mõõtmiseks kasutatav RT-PCR test viiruste inaktiveerimist märkimisväärselt alahinnata.Ag+ ioonide mõju ja reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) teke peaks vastutama testitud viiruste inaktiveerimise eest.Kuid paljud AgNP-MHC-de viirusevastaste mehhanismide aspektid on endiselt ebaselged ja AdV2 kõrge resistentsuse mehhanismi selgitamiseks on vaja täiendavaid biotehnoloogilisi lähenemisviise kasutavaid uuringuid.

Lõpuks hindasime Ag30-MHC-de viirusevastase aktiivsuse tugevust, eksponeerides need enne nende viirusevastase aktiivsuse mõõtmist paljudele pH väärtustele ning kraani- ja pinnaveeproovidele (Joonis 3jaja 4).4).Kokkupuude äärmiselt madala pH-ga põhjustas AgNP-de füüsilise ja/või funktsionaalse kadumise MHC-st (avaldamata andmed).Mittespetsiifiliste osakeste juuresolekul näitasid Ag30-MHC-d pidevalt viirusevastast toimet, hoolimata MS2-vastase viirusevastase aktiivsuse vähenemisest.Viirusevastane aktiivsus oli madalaim filtreerimata pinnavees, kuna interaktsioon Ag30-MHC ja mittespetsiifiliste osakeste vahel väga häguses pinnavees põhjustas tõenäoliselt viirusevastase aktiivsuse vähenemise (Tabel 3).Seetõttu tuleks tulevikus läbi viia AgNP-MHC-de välihinnangud erinevat tüüpi vees (nt erineva soolakontsentratsiooniga või humiinhappega).

Kokkuvõtteks võib öelda, et uutel Ag-komposiitidel, AgNP-MHC-del, on suurepärane viirusevastane võime mitmete viiruste, sealhulgas ϕX174 ja MNV vastu.AgNP-MHC-d säilitavad tugeva efektiivsuse erinevates keskkonnatingimustes ja neid osakesi saab magneti abil hõlpsasti kätte saada, vähendades seeläbi nende potentsiaalset kahjulikku mõju inimeste tervisele ja keskkonnale.See uuring näitas, et AgNP komposiit võib olla tõhus viirusevastane ravim erinevates keskkonnatingimustes ilma oluliste ökoloogiliste riskideta.