Hopeananohiukkasia (AgNP) pidetään potentiaalisesti hyödyllisenä työkaluna erilaisten patogeenien torjunnassa.AgNP:iden vapautuminen ympäristön väliaineisiin aiheuttaa kuitenkin huolta, koska ne voivat aiheuttaa haitallisia ihmisten terveyteen ja ekologisia vaikutuksia.Tässä tutkimuksessa kehitimme ja arvioimme uuden mikrometrin kokoisen magneettisen hybridikolloidin (MHC), joka oli koristeltu erikokoisilla AgNP:illä (AgNP-MHC).Desinfioinnin jälkeen nämä hiukkaset voidaan helposti ottaa talteen ympäristön väliaineista käyttämällä niiden magneettisia ominaisuuksia ja ne pysyvät tehokkaina viruspatogeenien inaktivoinnissa.Arvioimme AgNP-MHC:iden tehokkuuden bakteriofagin ϕX174, hiiren noroviruksen (MNV) ja adenoviruksen serotyypin 2 (AdV2) inaktivoinnissa.Nämä kohdevirukset altistettiin AgNP-MHC:ille 1, 3 ja 6 tunnin ajan 25 °C:ssa ja analysoitiin sitten plakkimäärityksellä ja reaaliaikaisella TaqMan PCR:llä.AgNP-MHC:t altistettiin monenlaisille pH-tasoille sekä vesijohto- ja pintavedelle niiden antiviraalisten vaikutusten arvioimiseksi erilaisissa ympäristöolosuhteissa.Kolmen testatun AgNP-MHC-tyypin joukosta Ag30-MHC:t osoittivat korkeinta tehoa virusten inaktivoinnissa.ϕX174 ja MNV pienenivät yli 2 log10 sen jälkeen, kun niitä oli altistettu 4,6 × 109 Ag30-MHC:lle/ml 1 tunnin ajan.Nämä tulokset osoittivat, että AgNP-MHC:itä voitaisiin käyttää viruspatogeenien inaktivoimiseen mahdollisimman pienellä mahdollisella vapautumismahdollisuudella ympäristöön.

Nanoteknologian viimeaikaisen edistyksen myötä nanopartikkeleihin on kiinnitetty lisääntyvää huomiota maailmanlaajuisesti biotekniikan, lääketieteen ja kansanterveyden aloilla.1,2).Korkean pinta-tilavuussuhteensa ansiosta nanokokoisilla materiaaleilla, jotka ovat tyypillisesti 10-500 nm, on ainutlaatuiset fysikaalis-kemialliset ominaisuudet verrattuna suurempiin materiaaleihin (1).Nanomateriaalien muotoa ja kokoa voidaan hallita ja tiettyjä funktionaalisia ryhmiä voidaan konjugoida niiden pinnoille mahdollistamaan vuorovaikutus tiettyjen proteiinien kanssa tai solunsisäinen sisäänotto (3,–5).

Hopean nanopartikkeleita (AgNP:itä) on tutkittu laajasti antimikrobisina aineina (6).Hopeaa käytetään hienojen ruokailuvälineiden valmistukseen, koristeluun ja terapeuttisiin aineisiin.Hopeayhdisteitä, kuten hopeasulfadiatsiinia ja tiettyjä suoloja, on käytetty haavanhoitotuotteina ja tartuntatautien hoidossa niiden antimikrobisten ominaisuuksien vuoksi.6,7).Viimeaikaiset tutkimukset ovat paljastaneet, että AgNP:t ovat erittäin tehokkaita erityyppisten bakteerien ja virusten inaktivoinnissa (8,–11).AgNP:istä vapautuvat AgNP:t ja Ag+-ionit ovat suoraan vuorovaikutuksessa fosforia tai rikkiä sisältävien biomolekyylien kanssa, mukaan lukien DNA, RNA ja proteiinit (12,–14).Niiden on myös osoitettu tuottavan reaktiivisia happilajeja (ROS) aiheuttaen kalvovaurioita mikro-organismeissa (15).AgNP:iden koko, muoto ja pitoisuus ovat myös tärkeitä tekijöitä, jotka vaikuttavat niiden antimikrobisiin kykyihin (8,10,13,16,17).

Aiemmat tutkimukset ovat myös tuoneet esiin useita ongelmia, kun AgNP:itä käytetään patogeenien torjuntaan vesiympäristössä.Ensinnäkin olemassa olevat tutkimukset AgNP:iden tehokkuudesta viruspatogeenien inaktivoinnissa vedessä ovat rajallisia.Lisäksi monodispergoituneet AgNP:t ovat tyypillisesti alttiina hiukkas-hiukkasaggregaatiolle niiden pienen koon ja suuren pinta-alan vuoksi, ja nämä aggregaatit vähentävät AgNP:iden tehokkuutta mikrobipatogeenejä vastaan ​​(7).Lopuksi AgNP:illä on osoitettu olevan erilaisia ​​sytotoksisia vaikutuksia (5,18,–20), ja AgNP-yhdisteiden vapautuminen vesiympäristöön voi johtaa ihmisten terveyteen ja ekologisiin ongelmiin.

Äskettäin kehitimme uuden mikrometrin kokoisen magneettisen hybridikolloidin (MHC), joka on koristeltu erikokoisilla AgNP:illä (21,22).MHC-ydintä voidaan käyttää AgNP-komposiittien talteenottamiseksi ympäristöstä.Arvioimme näiden hopeananohiukkasten antiviraalisen tehon MHC:ihin (AgNP-MHC) käyttämällä bakteriofagia ϕX174, hiiren norovirusta (MNV) ja adenovirusta erilaisissa ympäristöolosuhteissa.

AgNP-MHC:iden antiviraaliset vaikutukset eri pitoisuuksina bakteriofagia ϕX174 (a), MNV (b) ja AdV2:ta (c) vastaan.Kohdeviruksia käsiteltiin erilaisilla AgNP-MHC-konsentraatioilla ja OH-MHC:illa (4,6 x 109 hiukkasta/ml) kontrollina ravisteluinkubaattorissa (150 rpm, 1 h, 25 °C).Plakkimääritysmenetelmää käytettiin selviytyneiden virusten mittaamiseen.Arvot ovat keskiarvoja ± standardipoikkeamia (SD) kolmesta riippumattomasta kokeesta.Tähdet osoittavat merkittävästi erilaisia ​​arvoja (P< 0,05 yksisuuntaisella ANOVAlla Dunnettin testillä).

Tämä tutkimus osoitti, että AgNP-MHC:t ovat tehokkaita bakteriofagien ja MNV:n, ihmisen noroviruksen korvikkeen, inaktivoinnissa vedessä.Lisäksi AgNP-MHC:t voidaan helposti ottaa talteen magneetilla, mikä estää tehokkaasti mahdollisesti myrkyllisten AgNP:iden vapautumisen ympäristöön.Useat aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että AgNP:iden pitoisuus ja hiukkaskoko ovat kriittisiä tekijöitä kohdemikro-organismin inaktivoinnissa.8,16,17).AgNP:iden antimikrobiset vaikutukset riippuvat myös mikro-organismin tyypistä.AgNP-MHC:iden tehokkuus ϕX174:n inaktivoinnissa seurasi annos-vaste-suhdetta.Testattujen AgNP-MHC:iden joukossa Ag30-MHC:t olivat tehokkaampia ϕX174:n ja MNV:n inaktivoinnissa.MNV:llä vain Ag30-MHC:t osoittivat antiviraalista aktiivisuutta, kun taas muut AgNP-MHC:t eivät saaneet aikaan merkittävää MNV:n inaktivaatiota.Yhdelläkään AgNP-MHC:stä ei ollut merkittävää antiviraalista aktiivisuutta AdV2:ta vastaan.

Partikkelikoon lisäksi hopean pitoisuus AgNP-MHC:ssä oli myös tärkeä.Hopean pitoisuus näytti määrittävän AgNP-MHC:iden antiviraalisten vaikutusten tehokkuuden.Hopeakonsentraatiot Ag07-MHC- ja Ag30-MHC-liuoksissa pitoisuuksilla 4,6 × 109 hiukkasta/ml olivat 28,75 ppm ja 200 ppm, vastaavasti, ja korreloivat antiviraalisen aktiivisuuden tason kanssa.Taulukko 2tiivistää testattujen AgNP-MHC:iden hopeapitoisuudet ja pinta-alat.Ag07-MHC:illä oli alhaisin antiviraalinen aktiivisuus ja pienin hopeapitoisuus ja pinta-ala, mikä viittaa siihen, että nämä ominaisuudet liittyvät AgNP-MHC:iden antiviraaliseen aktiivisuuteen.

Edellinen tutkimuksemme osoitti, että AgNP-MHC:iden tärkeimmät antimikrobiset mekanismit ovat Mg2+- tai Ca2+-ionien kemiallinen poistaminen mikrobikalvoista, kompleksien luominen kalvoilla sijaitsevien tioliryhmien kanssa ja reaktiivisten happilajien (ROS) synnyttäminen (21).Koska AgNP-MHC:illä on suhteellisen suuri hiukkaskoko (~ 500 nm), on epätodennäköistä, että ne voivat tunkeutua viruskapsidiin.Sen sijaan AgNP-MHC:t näyttävät olevan vuorovaikutuksessa viruksen pintaproteiinien kanssa.Komposiiteilla olevilla AgNP:illä on taipumus sitoa tioliryhmän sisältäviä biomolekyylejä, jotka on upotettu virusten vaippaproteiineihin.Siksi viruskapsidiproteiinien biokemialliset ominaisuudet ovat tärkeitä määritettäessä niiden herkkyyttä AgNP-MHC:ille.Kuvio 1osoittaa virusten erilaiset herkkyydet AgNP-MHC:iden vaikutuksille.Bakteriofagit ϕX174 ja MNV olivat herkkiä AgNP-MHC:ille, mutta AdV2 oli resistentti.AdV2:n korkea resistanssitaso liittyy todennäköisesti sen kokoon ja rakenteeseen.Adenovirukset ovat kooltaan 70-100 nm.30), mikä tekee niistä paljon suurempia kuin ϕX174 (27-33 nm) ja MNV (28-35 nm) (31,32).Suuren kokonsa lisäksi adenoviruksilla on kaksijuosteinen DNA, toisin kuin muut virukset, ja ne kestävät erilaisia ​​ympäristön rasituksia, kuten lämpöä ja UV-säteilyä (33,34).Edellinen tutkimuksemme raportoi, että Ag30-MHC:llä tapahtui MS2:n väheneminen lähes 3 log10 6 tunnin sisällä (21).MS2 ja ϕX174 ovat samankokoisia erityyppisten nukleiinihappojen (RNA tai DNA) kanssa, mutta niillä on samanlainen inaktivaationopeus Ag30-MHC:iden toimesta.Sen vuoksi nukleiinihapon luonne ei näytä olevan tärkein tekijä AgNP-MHC-resistenssissä.Sen sijaan viruspartikkelin koko ja muoto näyttivät olevan tärkeämpiä, koska adenovirus on paljon suurempi virus.Ag30-MHC:t saavuttivat M13:n lähes 2 log10 vähennyksen 6 tunnissa (julkaisemattomat tietomme).M13 on yksijuosteinen DNA-virus (35) ja sen pituus on ~880 nm ja halkaisija 6,6 nm (36).Rihmamaisen bakteriofagin M13 inaktivaationopeus oli pienten, pyöreärakenteisten virusten (MNV, ϕX174 ja MS2) ja suuren viruksen (AdV2) välillä.

Tässä tutkimuksessa MNV:n inaktivaatiokinetiikka oli merkittävästi erilainen plakkimäärityksessä ja RT-PCR-määrityksessä (Kuvio 2bjajac).c).Molekyylimääritysten, kuten RT-PCR:n, tiedetään aliarvioivan merkittävästi virusten inaktivaationopeudet (25,28), kuten tutkimuksessamme havaittiin.Koska AgNP-MHC:t ovat vuorovaikutuksessa ensisijaisesti viruksen pinnan kanssa, ne vahingoittavat todennäköisemmin viruksen kuoriproteiineja kuin viruksen nukleiinihappoja.Siksi RT-PCR-määritys virusnukleiinihapon mittaamiseksi voi merkittävästi aliarvioida virusten inaktivoitumista.Ag+-ionien vaikutuksen ja reaktiivisten happilajien (ROS) muodostumisen pitäisi olla vastuussa testattujen virusten inaktivoitumisesta.Monet AgNP-MHC:iden antiviraalisten mekanismien näkökohdat ovat kuitenkin edelleen epäselviä, ja lisätutkimusta tarvitaan bioteknisiä lähestymistapoja käyttäen AdV2:n korkean resistenssin mekanismin selvittämiseksi.

Lopuksi arvioimme Ag30-MHC:iden antiviraalisen aktiivisuuden kestävyyttä altistamalla ne laajalle pH-arvoalueelle sekä vesijohto- ja pintavesinäytteille ennen niiden antiviraalisen aktiivisuuden mittaamista (Kuva 3jaja 4).4).Altistuminen erittäin alhaiselle pH:lle johti AgNP:iden fyysiseen ja/tai toiminnalliseen häviämiseen MHC:stä (julkaisematon data).Epäspesifisten hiukkasten läsnä ollessa Ag30-MHC:t osoittivat jatkuvasti antiviraalista aktiivisuutta huolimatta MS2:n vastaisen antiviraalisen aktiivisuuden laskusta.Antiviraalinen aktiivisuus oli alhaisin suodattamattomassa pintavedessä, koska Ag30-MHC:iden ja epäspesifisten hiukkasten välinen vuorovaikutus erittäin sameassa pintavedessä todennäköisesti aiheutti antiviraalisen aktiivisuuden vähenemisen (Taulukko 3).Siksi AgNP-MHC:iden kenttäarviointeja erityyppisissä vesissä (esim. eri suolapitoisuuksilla tai humushapolla) tulisi tehdä tulevaisuudessa.

Yhteenvetona voidaan todeta, että uusilla Ag-komposiiteilla, AgNP-MHC:illa, on erinomaiset antiviraaliset ominaisuudet useita viruksia vastaan, mukaan lukien ϕX174 ja MNV.AgNP-MHC:t säilyttävät vahvan tehonsa erilaisissa ympäristöolosuhteissa, ja nämä hiukkaset voidaan helposti ottaa talteen magneetin avulla, mikä vähentää niiden mahdollisia haitallisia vaikutuksia ihmisten terveyteen ja ympäristöön.Tämä tutkimus osoitti, että AgNP-komposiitti voi olla tehokas viruslääke erilaisissa ympäristöolosuhteissa ilman merkittäviä ekologisia riskejä.