Javascript está actualmente desactivado no teu navegador.Cando javascript está desactivado, algunhas funcións deste sitio web non funcionarán.
Rexistra os teus datos específicos e os teus medicamentos específicos de interese e relacionaremos a información que proporcionas cos artigos da nosa extensa base de datos e enviarémosche unha copia en PDF por correo electrónico de forma oportuna.
Son sempre mellores as nanopartículas máis pequenas?Comprender os efectos biolóxicos da agregación dependente do tamaño de nanopartículas de prata en condicións bioloxicamente relevantes
Autores: Bélteky P, Rónavári A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Kónya Z
Péter Bélteky,1,* Andrea Rónavári,1,* Dalma Zakupszky,1 Eszter Boka,1 Nóra Igaz,2 Bettina Szerencsés,3 Ilona Pfeiffer,3 Csaba Vágvölgyi,3 Mónika Kiricsi de Química Ambiental, Hungría, Facultade de Ciencias e Informática de Hungría , Universidade de Szeged;2 Departamento de Bioquímica e Bioloxía Molecular, Facultade de Ciencias e Información, Universidade de Szeged, Hungría;3 Departamento de Microbioloxía, Facultade de Ciencias e Información, Universidade de Szeged, Hungría;4MTA-SZTE Reaction Kinetics and Surface Chemistry Research Group, Szeged, Hungría* Estes autores contribuíron por igual a este traballo.Comunicación: Zoltán Kónya Departamento de Química Aplicada e Ambiental, Facultade de Ciencias e Informática, Universidade de Szeged, Rerrich Square 1, Szeged, H-6720, Hungría Teléfono +36 62 544620 Correo electrónico [Protección de correo electrónico] Propósito: As nanopartículas de prata (AgNP) son un dos nanomateriais máis estudados, especialmente polas súas aplicacións biomédicas.Non obstante, debido á agregación de nanopartículas, a súa excelente citotoxicidade e actividade antibacteriana adoitan estar comprometidas nos medios biolóxicos.Neste traballo, estudouse o comportamento de agregación e as actividades biolóxicas relacionadas de tres mostras diferentes de nanopartículas de prata terminadas en citrato cun diámetro medio de 10, 20 e 50 nm.Método: Utilizar o microscopio electrónico de transmisión para sintetizar e caracterizar nanopartículas, avaliar o seu comportamento de agregación a varios valores de pH, concentracións de NaCl, glicosa e glutamina mediante dispersión dinámica de luz e espectroscopia ultravioleta visible.Ademais, no medio de cultivo celular compoñentes como Dulbecco mellora o comportamento de agregación en Eagle Medium e Fetal Calf Serum.Resultados: os resultados mostran que o pH ácido e o contido fisiolóxico de electrólitos inducen xeralmente unha agregación a escala de micras, que pode estar mediada pola formación de coroa biomolecular.Paga a pena notar que as partículas máis grandes presentan unha maior resistencia ás influencias externas que as súas contrapartes máis pequenas.Realizáronse probas de citotoxicidade e antibacterianos in vitro tratando células con agregados de nanopartículas en diferentes etapas de agregación.Conclusión: os nosos resultados revelan unha profunda correlación entre a estabilidade coloidal e a toxicidade dos AgNPs, xa que a agregación extrema leva á perda completa da actividade biolóxica.O maior grao de antiagregación observado para partículas máis grandes ten un impacto significativo na toxicidade in vitro, porque tales mostras conservan máis actividade antimicrobiana e de células de mamíferos.Estes achados levan á conclusión de que, a pesar da opinión xeral da literatura relevante, dirixirse ás nanopartículas máis pequenas posibles pode non ser o mellor curso de acción.Palabras clave: crecemento mediado por sementes, estabilidade coloidal, comportamento de agregación dependente do tamaño, toxicidade da agregación.
A medida que a demanda e a produción de nanomateriais seguen aumentando, cada vez se presta máis atención á súa bioseguridade ou actividade biolóxica.As nanopartículas de prata (AgNP) son un dos representantes máis comúnmente sintetizados, investigados e utilizados desta clase de materiais debido ás súas excelentes propiedades catalíticas, ópticas e biolóxicas.1 En xeral, crese que as características únicas dos nanomateriais (incluíndo os AgNP) atribúense principalmente á súa gran superficie específica.Polo tanto, o problema inevitablemente é calquera proceso que afecte a esta característica clave, como o tamaño das partículas, o revestimento superficial ou a agregación, se pode danar gravemente as propiedades das nanopartículas que son críticas para aplicacións específicas.
Os efectos do tamaño das partículas e os estabilizadores son temas que foron relativamente ben documentados na literatura.Por exemplo, a opinión xeralmente aceptada é que as nanopartículas máis pequenas son máis tóxicas que as nanopartículas máis grandes.2 De acordo coa literatura xeral, os nosos estudos anteriores demostraron a actividade dependente do tamaño da nanoprata en células e microorganismos de mamíferos.3– 5 O revestimento superficial é outro atributo que ten unha ampla influencia nas propiedades dos nanomateriais.Só con engadir ou modificar estabilizadores na súa superficie, o mesmo nanomaterial pode ter propiedades físicas, químicas e biolóxicas completamente diferentes.A aplicación de axentes de captación realízase con máis frecuencia como parte da síntese de nanopartículas.Por exemplo, as nanopartículas de prata terminadas en citrato son un dos AgNP máis relevantes na investigación, que se sintetizan reducindo sales de prata nunha solución estabilizadora seleccionada como medio de reacción.6 O citrato pode aproveitar facilmente o seu baixo custo, dispoñibilidade, biocompatibilidade e forte afinidade pola prata, que se pode reflectir en varias interaccións propostas, desde a adsorción superficial reversible ata as interaccións iónicas.Moléculas pequenas e ións poliatómicos próximos ao 7,8, como citratos, polímeros, polielectrolitos e axentes biolóxicos tamén se usan habitualmente para estabilizar a nanoprata e realizar funcionalizacións únicas nel.9-12
Aínda que a posibilidade de alterar a actividade das nanopartículas mediante o recubrimento superficial intencionado é unha área moi interesante, o papel principal deste revestimento superficial é insignificante, proporcionando estabilidade coloidal ao sistema de nanopartículas.A gran superficie específica dos nanomateriais producirá unha gran enerxía superficial, o que dificulta a capacidade termodinámica do sistema para alcanzar a súa enerxía mínima.13 Sen unha estabilización adecuada, isto pode levar á aglomeración de nanomateriais.A agregación é a formación de agregados de partículas de diversas formas e tamaños que se produce cando as partículas dispersas se atopan e as interaccións termodinámicas actuais permiten que as partículas se adhiran entre si.Polo tanto, utilízanse estabilizadores para evitar a agregación introducindo unha forza repulsiva suficientemente grande entre as partículas para contrarrestar a súa atracción termodinámica.14
Aínda que o tema do tamaño das partículas e a cobertura superficial foi explorado a fondo no contexto da súa regulación das actividades biolóxicas desencadeadas polas nanopartículas, a agregación de partículas é unha área moi descoidada.Case non hai un estudo exhaustivo para resolver a estabilidade coloidal das nanopartículas en condicións bioloxicamente relevantes.10,15-17 Ademais, esta achega é especialmente rara, onde tamén se estudou a toxicidade asociada á agregación, aínda que poida provocar reaccións adversas, como trombose vascular, ou perda das características desexadas, como a súa toxicidade, como mostrado na Figura 1.18, 19 mostrado.De feito, un dos poucos mecanismos coñecidos de resistencia das nanopartículas de prata está relacionado coa agregación, porque se informa que determinadas cepas de E. coli e Pseudomonas aeruginosa reducen a súa sensibilidade á nanoprata ao expresar a flaxelina, a proteína flaxelina.Ten unha alta afinidade pola prata, polo que induce a agregación.20
Existen varios mecanismos diferentes relacionados coa toxicidade das nanopartículas de prata, e a agregación afecta a todos estes mecanismos.O método máis discutido de actividade biolóxica do AgNP, ás veces denominado mecanismo do "cabalo de Troia", considera os AgNP como portadores de Ag+.1,21 O mecanismo do cabalo de Troia pode garantir un gran aumento da concentración local de Ag+, o que leva á xeración de ROS e á despolarización da membrana.22-24 A agregación pode afectar á liberación de Ag+, afectando así á toxicidade, porque reduce a superficie activa efectiva onde os ións de prata poden oxidarse e disolverse.Non obstante, os AgNP non só mostrarán toxicidade pola liberación de ións.Hai que ter en conta moitas interaccións relacionadas co tamaño e a morfoloxía.Entre elas, o tamaño e a forma da superficie das nanopartículas son as características definitorias.4,25 A colección destes mecanismos pódese categorizar como "mecanismos de toxicidade inducida".Hai potencialmente moitas reaccións mitocondriais e de membrana superficial que poden danar os orgánulos e provocar a morte celular.25-27 Dado que a formación de agregados afecta naturalmente ao tamaño e á forma dos obxectos que conteñen prata recoñecidos polos sistemas vivos, estas interaccións tamén poden verse afectadas.
No noso artigo anterior sobre a agregación de nanopartículas de prata, demostramos un procedemento de cribado eficaz que consiste en experimentos químicos e biolóxicos in vitro para estudar este problema.19 A dispersión dinámica de luz (DLS) é a técnica preferida para este tipo de inspeccións porque o material pode dispersar fotóns a unha lonxitude de onda comparable ao tamaño das súas partículas.Dado que a velocidade de movemento browniano das partículas no medio líquido está relacionada co tamaño, o cambio na intensidade da luz dispersa pódese usar para determinar o diámetro hidrodinámico medio (Z-media) da mostra líquida.28 Ademais, aplicando unha tensión á mostra, o potencial zeta (potencial ζ) da nanopartícula pódese medir de forma similar ao valor medio Z.13,28 Se o valor absoluto do potencial zeta é o suficientemente alto (segundo as directrices xerais> ± 30 mV), xerará unha forte repulsión electrostática entre as partículas para contrarrestar a agregación.A resonancia de plasmóns de superficie característica (SPR) é un fenómeno óptico único, atribuído principalmente a nanopartículas de metais preciosos (principalmente Au e Ag).29​​ En base ás oscilacións electrónicas (plasmóns de superficie) destes materiais a nanoescala, sábese que os AgNP esféricos teñen un pico característico de absorción UV-Vis preto dos 400 nm.30 O cambio de intensidade e lonxitude de onda das partículas úsase para complementar os resultados do DLS, xa que este método pode usarse para detectar a agregación de nanopartículas e a adsorción superficial de biomoléculas.
En base á información obtida, realízanse ensaios de viabilidade celular (MTT) e antibacterianos de forma que a toxicidade do AgNP se describe como unha función do nivel de agregación, en lugar de (o factor máis utilizado) da concentración de nanopartículas.Este método único permítenos demostrar a profunda importancia do nivel de agregación na actividade biolóxica, porque, por exemplo, os AgNP terminados en citrato perden completamente a súa actividade biolóxica en poucas horas debido á agregación.19
No traballo actual, pretendemos ampliar moito as nosas contribucións anteriores na estabilidade dos coloides bio-relacionados e o seu impacto na actividade biolóxica estudando o efecto do tamaño das nanopartículas na agregación de nanopartículas.Este é, sen dúbida, un dos estudos das nanopartículas.Unha perspectiva de maior perfil e 31 Para investigar esta cuestión, utilizouse un método de crecemento mediado por sementes para producir AgNPs terminados en citrato en tres intervalos de tamaño diferentes (10, 20 e 50 nm).6,32 como un dos métodos máis comúns.Para os nanomateriais que se usan de forma ampla e habitual en aplicacións médicas, selecciónanse AgNPs terminados en citrato de diferentes tamaños para estudar a posible dependencia do tamaño das propiedades biolóxicas da nanoprata relacionadas coa agregación.Despois de sintetizar AgNPs de diferentes tamaños, caracterizamos as mostras producidas mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) e despois examinamos as partículas mediante o procedemento de cribado anteriormente mencionado.Ademais, en presenza de cultivos celulares in vitro Medio de aguia modificado de Dulbecco (DMEM) e soro bovino fetal (FBS), avaliouse o comportamento de agregación dependente do tamaño e o seu comportamento a varios valores de pH, concentracións de NaCl, glicosa e glutamina.As características da citotoxicidade determínanse en condicións amplas.O consenso científico indica que, en xeral, son preferibles as partículas máis pequenas;a nosa investigación proporciona unha plataforma química e biolóxica para determinar se este é o caso.
Tres nanopartículas de prata con diferentes rangos de tamaño foron preparadas polo método de crecemento mediado por sementes proposto por Wan et al., con lixeiros axustes.6 Este método baséase na redución química, utilizando nitrato de prata (AgNO3) como fonte de prata, borohidruro de sodio (NaBH4) como axente redutor e citrato de sodio como estabilizador.En primeiro lugar, prepare 75 ml de solución acuosa de citrato 9 mM a partir de citrato de sodio dihidratado (Na3C6H5O7 x 2H2O) e quenta a 70 °C.A continuación, engadíronse 2 mL de solución de AgNO3 ao 1% p/v ao medio de reacción e, a continuación, a solución de borohidruro sódico recén preparada (2 mL 0,1% p/v) foi vertida na mestura gota a gota.A suspensión amarela-marrón resultante mantívose a 70 °C con axitación vigorosa durante 1 hora, e despois arrefriouse a temperatura ambiente.A mostra resultante (de agora en diante denominada AgNP-I) utilízase como base para o crecemento mediado por sementes no seguinte paso de síntese.
Para sintetizar unha suspensión de partículas de tamaño medio (denominada AgNP-II), quenta 90 ml de solución de citrato 7,6 mM a 80 °C, mestúraa con 10 ml de AgNP-I e despois mestura 2 ml de solución de AgNO3 ao 1% p/v. mantívose baixo unha vigorosa axitación mecánica durante 1 hora, e despois a mostra arrefriouse a temperatura ambiente.
Para a partícula máis grande (AgNP-III), repita o mesmo proceso de crecemento, pero neste caso, use 10 mL de AgNP-II como suspensión de sementes.Despois de que as mostras alcanzan a temperatura ambiente, establecen a súa concentración nominal de Ag en función do contido total de AgNO3 en 150 ppm engadindo ou evaporando disolvente adicional a 40 °C e, finalmente, gárdanas a 4 °C ata o seu novo uso.
Use o microscopio electrónico de transmisión (TEM) FEI Tecnai G2 20 X-Twin (sede corporativa de FEI, Hillsboro, Oregón, EUA) cunha tensión de aceleración de 200 kV para examinar as características morfolóxicas das nanopartículas e capturar o seu patrón de difracción de electróns (ED).Avaliáronse polo menos 15 imaxes representativas (~ 750 partículas) usando o paquete de software ImageJ e os histogramas resultantes (e todos os gráficos de todo o estudo) creáronse en OriginPro 2018 (OriginLab, Northampton, MA, EUA) 33, 34.
Mediuse o diámetro hidrodinámico medio (media Z), o potencial zeta (potencial ζ) e a resonancia plasmática de superficie característica (SPR) das mostras para ilustrar as súas propiedades coloidais iniciais.O diámetro hidrodinámico medio e o potencial zeta da mostra foron medidos polo instrumento Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido) utilizando células capilares desbotables dobradas a 37±0,1 °C.Utilizouse o espectrofotómetro UV-Vis Ocean Optics 355 DH-2000-BAL (Halma PLC, Largo, FL, EUA) para obter as características SPR características dos espectros de absorción UV-Vis de mostras no intervalo de 250-800 nm.
Durante todo o experimento realizáronse ao mesmo tempo tres tipos de medición diferentes relacionados coa estabilidade coloidal.Use DLS para medir o diámetro hidrodinámico medio (media Z) e o potencial zeta (potencial ζ) das partículas, porque a media Z está relacionada co tamaño medio dos agregados de nanopartículas, e o potencial zeta indica se a repulsión electrostática no sistema. é o suficientemente forte como para compensar a atracción de Van der Waals entre as nanopartículas.As medicións realízanse por triplicado e a desviación estándar da media Z e do potencial zeta calcúlase mediante o software Zetasizer.Os espectros SPR característicos das partículas avalíanse mediante espectroscopia UV-Vis, porque os cambios na intensidade máxima e na lonxitude de onda poden indicar agregación e interaccións na superficie.29,35 De feito, a resonancia do plasmón superficial nos metais preciosos ten tanta influencia que levou a novos métodos de análise de biomoléculas.29,36,37 A concentración de AgNPs na mestura experimental é de aproximadamente 10 ppm, e o propósito é establecer a intensidade da máxima absorción inicial de SPR en 1. O experimento realizouse de forma dependente do tempo a 0;1,5;3;6;12 e 24 horas en varias condicións bioloxicamente relevantes.Podes ver máis detalles que describen o experimento no noso traballo anterior.19 En resumo, varios valores de pH (3; 5; 7,2 e 9), diferentes concentracións de cloruro de sodio (10 mM; 50 mM; 150 mM), glicosa (3,9 mM; 6,7 mM) e glutamina (4 mM), e tamén preparou o Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco e o Suero Bovino Fetal (FBS) (en auga e DMEM) como sistemas modelo, e estudou os seus efectos no comportamento de agregación das nanopartículas de prata sintetizadas.pH Os valores de NaCl, glicosa e glutamina avalíanse en función das concentracións fisiolóxicas, mentres que as cantidades de DMEM e FBS son as mesmas que as utilizadas en todo o experimento in vitro.38-42 Todas as medicións realizáronse a pH 7,2 e 37 °C cunha concentración de sal de fondo constante de NaCl 10 mM para eliminar calquera interacción de partículas a longa distancia (excepto en certos experimentos relacionados co pH e NaCl, onde estes atributos son as variables baixo estudo).28 A lista de varias condicións resúmese na táboa 1. O experimento marcado con † utilízase como referencia e corresponde a unha mostra que contén NaCl 10 mM e pH 7,2.
A liña celular de cancro de próstata humano (DU145) e os queratinocitos humanos inmortalizados (HaCaT) obtivéronse de ATCC (Manassas, VA, EUA).As células cultívanse rutineiramente no medio esencial mínimo Eagle (DMEM) de Dulbecco que contén 4,5 g/L de glicosa (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EUA), complementado con 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 0,01% de estreptomicina e 0,005% Penicilina (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA).As células cultívanse nunha incubadora a 37 °C con 5% de CO2 e 95% de humidade.
Co fin de explorar os cambios na citotoxicidade do AgNP causados ​​pola agregación de partículas dun xeito dependente do tempo, realizouse un ensaio MTT en dous pasos.En primeiro lugar, mediuse a viabilidade dos dous tipos celulares despois do tratamento con AgNP-I, AgNP-II e AgNP-III.Para iso, sementáronse os dous tipos de células en placas de 96 pocillos cunha densidade de 10.000 células/pozo e tratáronse con tres tamaños diferentes de nanopartículas de prata en concentracións crecentes o segundo día.Despois de 24 horas de tratamento, as células laváronse con PBS e incubáronse con 0,5 mg/ml de reactivo MTT (SERVA, Heidelberg, Alemaña) diluído en medio de cultivo durante 1 hora a 37 °C.Os cristais de formazán disolvéronse en DMSO (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EUA) e a absorción mediuse a 570 nm usando un lector de placas Synergy HTX (BioTek-Hungary, Budapest, Hungría).O valor de absorción da mostra de control non tratada considérase como unha taxa de supervivencia do 100%.Realiza polo menos 3 experimentos utilizando catro réplicas biolóxicas independentes.O IC50 calcúlase a partir dunha curva de resposta á dose baseada nos resultados de vitalidade.
Despois, no segundo paso, ao incubar as partículas con NaCl 150 mM durante diferentes períodos de tempo (0, 1,5, 3, 6, 12 e 24 horas) antes do tratamento celular, producíronse diferentes estados de agregación de nanopartículas de prata.Posteriormente, realizouse o mesmo ensaio MTT que se describiu anteriormente para avaliar os cambios na viabilidade celular afectadas pola agregación de partículas.Use GraphPad Prism 7 para avaliar o resultado final, calcular a significación estatística do experimento mediante a proba t non pareada e marcar o seu nivel como * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01), *** (p ≤ 0,001). ) E **** (p ≤ 0,0001).
Utilizáronse tres tamaños diferentes de nanopartículas de prata (AgNP-I, AgNP-II e AgNP-III) para a susceptibilidade antibacteriana a Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM; Research Center for Pathogenic Fungi and Microbial Toxicology, Chiba University) e Bacillus Test megaterium SZMC 60311. (SZMC: Szeged Microbiology Collection) e E. coli SZMC 0582 en medio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Co.).Para avaliar os cambios na actividade antibacteriana causados ​​pola agregación de partículas, en primeiro lugar, determinouse a súa concentración inhibitoria mínima (MIC) por microdilución nunha placa de microtitulación de 96 pocillos.A 50 μL de suspensión celular estandarizada (5 × 104 células/mL en medio RPMI 1640), engade 50 μL de suspensión de nanopartículas de prata e dilúa en serie dúas veces a concentración (no medio mencionado, o intervalo é de 0 e 75 ppm, é dicir, a mostra de control contén 50 μL de suspensión celular e 50 μL de medio sen nanopartículas).Despois, a placa foi incubada a 30 ° C durante 48 horas, e a densidade óptica do cultivo foi medida a 620 nm usando un lector de placas SPECTROstar Nano (BMG LabTech, Offenburg, Alemaña).O experimento realizouse tres veces por triplicado.
Excepto que neste momento se utilizaron 50 μL de mostras de nanopartículas únicas agregadas, utilizouse o mesmo procedemento que o descrito anteriormente para examinar o efecto da agregación sobre a actividade antibacteriana nas cepas mencionadas anteriormente.Prodúcense diferentes estados de agregación de nanopartículas de prata incubando as partículas con NaCl 150 mM durante diferentes períodos de tempo (0, 1,5, 3, 6, 12 e 24 horas) antes do procesamento celular.Como control do crecemento utilizouse unha suspensión suplementada con 50 μL de medio RPMI 1640, mentres que para controlar a toxicidade utilizouse unha suspensión con nanopartículas non agregadas.O experimento realizouse tres veces por triplicado.Use GraphPad Prism 7 para avaliar o resultado final de novo, utilizando a mesma análise estatística que a análise MTT.
Caracterizouse o nivel de agregación das partículas máis pequenas (AgNP-I) e os resultados publicáronse parcialmente no noso traballo anterior, pero para unha mellor comparación, todas as partículas foron examinadas a fondo.Os datos experimentais son recollidos e discutidos nas seguintes seccións.Tres tamaños de AgNP.19
As medicións realizadas por TEM, UV-Vis e DLS verificaron a síntese exitosa de todas as mostras de AgNP (Figura 2A-D).Segundo a primeira fila da figura 2, a partícula máis pequena (AgNP-I) mostra unha morfoloxía esférica uniforme cun diámetro medio duns 10 nm.O método de crecemento mediado por sementes tamén proporciona AgNP-II e AgNP-III con diferentes intervalos de tamaño con diámetros de partículas medios de aproximadamente 20 nm e 50 nm, respectivamente.Segundo a desviación estándar da distribución de partículas, os tamaños das tres mostras non se solapan, o que é importante para a súa análise comparativa.Ao comparar a relación de aspecto medio e a relación de delgadez das proxeccións 2D de partículas baseadas en TEM, suponse que a esfericidade das partículas é avaliada polo complemento de filtro de forma de ImageJ (Figura 2E).43 Segundo a análise da forma das partículas, a súa relación de aspecto (lado grande/lado curto do rectángulo delimitador máis pequeno) non se ve afectada polo crecemento das partículas e a súa relación de delgadez (área medida do círculo perfecto/área teórica correspondente). ) diminúe gradualmente.Isto dá como resultado cada vez máis partículas poliédricas, que en teoría son perfectamente redondas, correspondentes a unha relación de delgadez de 1.
Figura 2 Imaxe de microscopio electrónico de transmisión (TEM) (A), patrón de difracción de electróns (ED) (B), histograma de distribución de tamaños (C), espectro de absorción de luz característica ultravioleta-visible (UV-Vis) (D) e citrato de fluído medio. As nanopartículas de prata terminadas con diámetro mecánico (media Z), potencial zeta, relación de aspecto e relación de espesor (E) teñen tres rangos de tamaño diferentes: AgNP-I é de 10 nm (fila superior), AgNP -II é de 20 nm (fila media). ), AgNP-III (fila inferior) é de 50 nm.
Aínda que a natureza cíclica do método de crecemento afectou ata certo punto á forma das partículas, o que provocou a menor esfericidade dos AgNP máis grandes, as tres mostras permaneceron case esféricas.Ademais, como se mostra no patrón de difracción de electróns da Figura 2B, nano A cristalinidade das partículas non se ve afectada.O anel de difracción destacado, que pode correlacionarse cos índices de Miller (111), (220), (200) e (311) da prata, é moi consistente coa literatura científica e as nosas contribucións anteriores.9, 19,44 A fragmentación do anel Debye-Scherrer de AgNP-II e AgNP-III débese ao feito de que a imaxe ED é capturada co mesmo aumento, polo que a medida que aumenta o tamaño das partículas, o número de partículas difractadas por aumenta e diminúe a área unitaria.
Sábese que o tamaño e a forma das nanopartículas afectan á actividade biolóxica.3,45 A actividade catalítica e biolóxica dependente da forma pódese explicar polo feito de que formas diferentes tenden a proliferar certas caras de cristal (tendo diferentes índices de Miller), e estas caras de cristal teñen diferentes actividades.45,46 Dado que as partículas preparadas proporcionan resultados similares de ED correspondentes a características de cristal moi similares, pódese supoñer que nos nosos posteriores experimentos de estabilidade coloidal e actividade biolóxica, calquera diferenza observada debe atribuírse ao tamaño das nanopartículas, non ás propiedades relacionadas coa forma.
Os resultados de UV-Vis resumidos na Figura 2D enfatizan aínda máis a natureza esférica esmagadora do AgNP sintetizado, porque os picos SPR das tres mostras están ao redor de 400 nm, que é un valor característico das nanopartículas de prata esféricas.29,30 Os espectros capturados tamén confirmaron o crecemento exitoso da nanoprata mediado por sementes.A medida que aumenta o tamaño das partículas, a lonxitude de onda correspondente á máxima absorción de luz de AgNP-II, de xeito máis destacado, segundo a literatura, AgNP-III experimentou un desprazamento ao vermello.6,29
En canto á estabilidade coloidal inicial do sistema AgNP, utilizouse DLS para medir o diámetro hidrodinámico medio e o potencial zeta das partículas a pH 7,2.Os resultados mostrados na Figura 2E mostran que AgNP-III ten unha estabilidade coloidal maior que AgNP-I ou AgNP-II, porque as directrices comúns indican que é necesario un potencial zeta de 30 mV absoluto para a estabilidade coloidal a longo prazo. o valor medio Z (obtido como o diámetro hidrodinámico medio das partículas libres e agregadas) compárase co tamaño das partículas primarias obtidas por TEM, porque canto máis preto estean os dous valores, máis suave será o grao de recollida na mostra.De feito, a media Z de AgNP-I e AgNP-II é razoablemente maior que o seu tamaño de partícula principal avaliado por TEM, polo que, en comparación co AgNP-III, prevese que estas mostras teñan máis probabilidades de agregarse, onde o potencial zeta altamente negativo. vai acompañado dun tamaño próximo O valor medio Z.
A explicación deste fenómeno pode ser dobre.Por unha banda, a concentración de citrato mantense a un nivel similar en todos os pasos da síntese, proporcionando unha cantidade relativamente alta de grupos de superficie cargados para evitar que a superficie específica das partículas en crecemento diminúa.Non obstante, segundo Levak et al., moléculas pequenas como o citrato poden ser facilmente intercambiadas por biomoléculas na superficie das nanopartículas.Neste caso, a estabilidade coloidal virá determinada pola coroa das biomoléculas producidas.31 Debido a que este comportamento tamén se observou nas nosas medicións de agregación (discutidas con máis detalle máis adiante), o límite de citrato por si só non pode explicar este fenómeno.
Por outra banda, o tamaño das partículas é inversamente proporcional á tendencia de agregación a nivel nanómetro.Isto é apoiado principalmente polo método tradicional Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO), onde a atracción de partículas descríbese como a suma das forzas de atracción e repulsión entre partículas.Segundo He et al., o valor máximo da curva de enerxía DLVO diminúe co tamaño das nanopartículas nas nanopartículas de hematita, o que facilita alcanzar a enerxía primaria mínima, promovendo así a agregación irreversible (condensación).47 Non obstante, especúlase que hai outros aspectos máis aló das limitacións da teoría DLVO.Aínda que a gravidade de van der Waals e a repulsión electrostática de dobre capa son similares co aumento do tamaño das partículas, unha revisión de Hotze et al.propón que ten un efecto máis forte sobre a agregación do que permite DLVO.14 Cren que a curvatura superficial das nanopartículas xa non se pode estimar como unha superficie plana, polo que a estimación matemática non é aplicable.Ademais, a medida que diminúe o tamaño das partículas, a porcentaxe de átomos presentes na superficie aumenta, o que leva a unha estrutura electrónica e un comportamento de carga superficial.E a reactividade da superficie cambia, o que pode levar a unha diminución da carga na dobre capa eléctrica e favorecer a agregación.
Ao comparar os resultados DLS de AgNP-I, AgNP-II e AgNP-III na Figura 3, observamos que as tres mostras mostraban un pH similar que provocaba a agregación.Un ambiente moi ácido (pH 3) cambia o potencial zeta da mostra a 0 mV, o que fai que as partículas formen agregados de tamaño micrométrico, mentres que o pH alcalino cambia o seu potencial zeta a un valor negativo maior, onde as partículas forman agregados máis pequenos (pH 5). ).E 7,2) ), ou permanecen completamente sen agregar (pH 9).Tamén se observaron algunhas diferenzas importantes entre as diferentes mostras.Ao longo do experimento, AgNP-I demostrou ser o máis sensible aos cambios de potencial zeta inducidos polo pH, porque o potencial zeta destas partículas reduciuse a pH 7,2 en comparación con pH 9, mentres que AgNP-II e AgNP-III só mostraron A. un cambio considerable en ζ está en torno ao pH 3. Ademais, AgNP-II mostrou cambios máis lentos e un potencial zeta moderado, mentres que AgNP-III mostrou o comportamento máis suave dos tres, porque o sistema mostrou o valor zeta absoluto máis alto e un movemento de tendencia lento, o que indica AgNP-III Máis resistente á agregación inducida polo pH.Estes resultados son consistentes cos resultados da medición do diámetro hidrodinámico medio.Tendo en conta o tamaño das partículas dos seus cebadores, o AgNP-I mostrou unha agregación gradual constante en todos os valores de pH, moi probablemente debido ao fondo de NaCl 10 mM, mentres que o AgNP-II e o AgNP-III só mostraron significativo a pH 3 de recollida.A diferenza máis interesante é que a pesar do seu gran tamaño de nanopartículas, AgNP-III forma os agregados máis pequenos a pH 3 en 24 horas, destacando as súas propiedades antiagregación.Ao dividir a Z media de AgNPs a pH 3 despois de 24 horas polo valor da mostra preparada, pódese observar que os tamaños agregados relativos de AgNP-I e AgNP-II aumentaron 50 veces, 42 veces e 22 veces. , respectivamente.III.
Figura 3 Os resultados de dispersión dinámica da luz da mostra de nanopartículas de prata terminadas en citrato con tamaño crecente (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II e 50 nm: AgNP-III) exprésanse como o diámetro hidrodinámico medio (Z media). ) (dereita) En condicións de pH diferentes, o potencial zeta (esquerda) cambia en 24 horas.
A agregación dependente do pH observada tamén afectou á característica resonancia plasmática de superficie (SPR) das mostras de AgNP, como demostran os seus espectros UV-Vis.Segundo a Figura complementaria S1, a agregación das tres suspensións de nanopartículas de prata vai seguida dunha redución da intensidade dos seus picos de SPR e un cambio ao vermello moderado.A extensión destes cambios en función do pH é consistente co grao de agregación previsto polos resultados do DLS, con todo, observáronse algunhas tendencias interesantes.En contra da intuición, resulta que o AgNP-II de tamaño medio é o máis sensible aos cambios de SPR, mentres que as outras dúas mostras son menos sensibles.Na investigación SPR, 50 nm é o límite teórico de tamaño de partícula, que se usa para distinguir as partículas en función das súas propiedades dieléctricas.As partículas menores de 50 nm (AgNP-I e AgNP-II) poden describirse como dipolos dieléctricos simples, mentres que as partículas que alcanzan ou superan este límite (AgNP-III) teñen propiedades dieléctricas máis complexas, e a súa resonancia A banda divídese en cambios multimodais. .No caso de dúas mostras de partículas máis pequenas, os AgNP pódense considerar dipolos simples, e o plasma pode superpoñerse facilmente.A medida que aumenta o tamaño das partículas, este acoplamento produce esencialmente un plasma maior, o que pode explicar a maior sensibilidade observada.29 Porén, para as partículas máis grandes, a simple estimación do dipolo non é válida cando tamén se poden producir outros estados de acoplamento, o que pode explicar a tendencia diminuída do AgNP-III a indicar cambios espectrais.29
Baixo as nosas condicións experimentais, está demostrado que o valor do pH ten un profundo efecto sobre a estabilidade coloidal das nanopartículas de prata recubertas de citrato de varios tamaños.Nestes sistemas, a estabilidade é proporcionada polos grupos -COO- cargados negativamente na superficie dos AgNP.O grupo funcional carboxilato do ión citrato protonase nun gran número de ións H+, polo que o grupo carboxilo xerado xa non pode proporcionar repulsión electrostática entre as partículas, como se mostra na fila superior da Figura 4. Segundo o principio de Le Chatelier, AgNP as mostras agrúganse rapidamente a pH 3, pero gradualmente fanse cada vez máis estables a medida que aumenta o pH.
Figura 4 Mecanismo esquemático da interacción superficial definido pola agregación baixo diferentes pH (fila superior), concentración de NaCl (fila media) e biomoléculas (fila inferior).
Segundo a Figura 5, tamén se examinou a estabilidade coloidal en suspensións de AgNP de diferentes tamaños baixo concentracións crecentes de sal.Baseándose no potencial zeta, o aumento do tamaño das nanopartículas nestes sistemas AgNP terminados en citrato proporciona novamente unha maior resistencia ás influencias externas do NaCl.No AgNP-I, 10 mM de NaCl é suficiente para inducir unha agregación leve, e unha concentración de sal de 50 mM proporciona resultados moi similares.En AgNP-II e AgNP-III, NaCl 10 mM non afecta significativamente o potencial zeta porque os seus valores permanecen en (AgNP-II) ou por debaixo (AgNP-III) -30 mV.Aumentar a concentración de NaCl a 50 mM e finalmente a 150 mM de NaCl é suficiente para reducir significativamente o valor absoluto do potencial zeta en todas as mostras, aínda que as partículas máis grandes manteñen máis carga negativa.Estes resultados son consistentes co diámetro hidrodinámico medio esperado dos AgNPs;as liñas de tendencia media Z medidas en 10, 50 e 150 mM de NaCl mostran valores diferentes, aumentando gradualmente.Finalmente, detectáronse agregados de tamaño micrón nos tres experimentos de 150 mM.
Figura 5 Os resultados da dispersión dinámica da luz da mostra de nanopartículas de prata terminadas en citrato con tamaño crecente (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II e 50 nm: AgNP-III) exprésanse como o diámetro hidrodinámico medio (Z media). ) (dereita) e o potencial zeta (esquerda) cambian en 24 horas en diferentes concentracións de NaCl.
Os resultados UV-Vis na figura complementaria S2 mostran que o SPR de 50 e 150 mM de NaCl nas tres mostras ten unha diminución instantánea e significativa.Isto pódese explicar polo DLS, porque a agregación baseada en NaCl ocorre máis rápido que os experimentos dependentes do pH, o que se explica pola gran diferenza entre as primeiras medicións (0, 1,5 e 3 horas).Ademais, o aumento da concentración de sal tamén aumentará a permitividade relativa do medio experimental, o que terá un profundo efecto na resonancia do plasmón superficial.29
O efecto do NaCl resúmese na fila do medio da Figura 4. En xeral, pódese concluír que o aumento da concentración de cloruro de sodio ten un efecto similar ao aumento da acidez, porque os ións Na+ teñen tendencia a coordinarse arredor dos grupos carboxilato. suprimindo os AgNPs potencial zeta negativos.Ademais, 150 mM de NaCl produciu agregados de tamaño de micras nas tres mostras, o que indica que a concentración fisiolóxica de electrólitos é prexudicial para a estabilidade coloidal dos AgNP terminados en citrato.Ao considerar a concentración crítica de condensación (CCC) de NaCl en sistemas AgNP similares, estes resultados pódense colocar intelixentemente na literatura relevante.Huynh et al.calculou que o CCC de NaCl para nanopartículas de prata terminadas en citrato cun diámetro medio de 71 nm era de 47,6 mM, mentres que El Badawy et al.observou que o CCC de AgNPs de 10 nm con revestimento de citrato era de 70 mM.10,16 Ademais, o CCC significativamente alto duns 300 mM foi medido por He et al., o que provocou que o seu método de síntese fose diferente da publicación mencionada anteriormente.48 Aínda que a contribución actual non está dirixida a unha análise exhaustiva destes valores, porque as nosas condicións experimentais están aumentando na complexidade de todo o estudo, a concentración de NaCl bioloxicamente relevante de 50 mM, especialmente NaCl 150 mM, parece ser bastante alta.Coagulación inducida, explicando os fortes cambios detectados.
O seguinte paso no experimento de polimerización é utilizar moléculas sinxelas pero bioloxicamente relevantes para simular interaccións nanopartículas-biomoléculas.Baseándose nos resultados DLS (Figuras 6 e 7) e UV-Vis (Figuras complementarias S3 e S4), pódense afirmar algunhas conclusións xerais.Nas nosas condicións experimentais, as moléculas estudadas de glicosa e glutamina non inducirán a agregación en ningún sistema AgNP, porque a tendencia Z-mean está estreitamente relacionada co valor de medición de referencia correspondente.Aínda que a súa presenza non afecta á agregación, os resultados experimentais mostran que estas moléculas están parcialmente adsorbidas na superficie dos AgNP.O resultado máis destacado que apoia esta visión é o cambio observado na absorción da luz.Aínda que o AgNP-I non presenta cambios significativos de lonxitude de onda ou intensidade, pódese observar con máis claridade medindo partículas máis grandes, o que probablemente se deba á maior sensibilidade óptica mencionada anteriormente.Independentemente da concentración, a glicosa pode causar un maior desprazamento ao vermello despois de 1,5 horas en comparación coa medición de control, que é duns 40 nm en AgNP-II e uns 10 nm en AgNP-III, o que proba a aparición de interaccións na superficie.A glutamina mostrou unha tendencia similar, pero o cambio non era tan obvio.Ademais, tamén vale a pena mencionar que a glutamina pode reducir o potencial zeta absoluto das partículas medianas e grandes.Non obstante, dado que estes cambios zeta non parecen afectar o nivel de agregación, pódese especular que incluso pequenas biomoléculas como a glutamina poden proporcionar un certo grao de repulsión espacial entre partículas.
Figura 6 Os resultados de dispersión dinámica da luz de mostras de nanopartículas de prata terminadas en citrato con tamaño crecente (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II e 50 nm: AgNP-III) exprésanse como o diámetro hidrodinámico medio (media Z) (dereita) En condicións externas de diferentes concentracións de glicosa, o potencial zeta (esquerda) cambia en 24 horas.
Figura 7 Os resultados da dispersión dinámica da luz da mostra de nanopartículas de prata terminadas en citrato con tamaño crecente (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II e 50 nm: AgNP-III) exprésanse como o diámetro hidrodinámico medio (Z media). ) (dereita) En presenza de glutamina, o potencial zeta (esquerda) cambia en 24 horas.
En resumo, pequenas biomoléculas como a glicosa e a glutamina non afectan á estabilidade coloidal na concentración medida: aínda que afectan o potencial zeta e os resultados UV-Vis en diferentes graos, os resultados medios Z non son consistentes.Isto indica que a adsorción superficial das moléculas inhibe a repulsión electrostática, pero ao mesmo tempo proporciona estabilidade dimensional.
Co fin de vincular os resultados anteriores cos resultados anteriores e simular as condicións biolóxicas con máis habilidade, seleccionamos algúns dos compoñentes de cultivos celulares máis utilizados e utilizámolos como condicións experimentais para estudar a estabilidade dos coloides AgNP.En todo o experimento in vitro, unha das funcións máis importantes do DMEM como medio é establecer as condicións osmóticas necesarias, pero dende o punto de vista químico, trátase dunha disolución salina complexa cunha forza iónica total similar á de NaCl 150 mM. .40 En canto á FBS, trátase dunha mestura complexa de biomoléculas -principalmente proteínas- desde o punto de vista da adsorción superficial, presenta algunhas semellanzas cos resultados experimentais de glicosa e glutamina, a pesar da composición química e da diversidade O sexo é moito máis complicado.19 DLS e UV-Os resultados visibles que se mostran na figura 8 e na figura complementaria S5, respectivamente, pódense explicar examinando a composición química destes materiais e correlacionándoos coas medicións da sección anterior.
Figura 8 Os resultados da dispersión dinámica da luz da mostra de nanopartículas de prata terminadas en citrato cun tamaño crecente (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II e 50 nm: AgNP-III) exprésanse como o diámetro hidrodinámico medio (media Z). ) (dereita) En presenza de compoñentes de cultivo celular DMEM e FBS, o potencial zeta (esquerda) cambia en 24 horas.
A dilución de AgNPs de diferentes tamaños en DMEM ten un efecto similar na estabilidade coloidal ao observado en presenza de altas concentracións de NaCl.A dispersión de AgNP en DMEM 50 v/v% mostrou que se detectou agregación a gran escala co aumento do potencial zeta e do valor medio Z e a forte diminución da intensidade de SPR.Cabe sinalar que o tamaño máximo de agregado inducido polo DMEM despois de 24 horas é inversamente proporcional ao tamaño das nanopartículas de cebador.
A interacción entre FBS e AgNP é similar á observada en presenza de moléculas máis pequenas como a glicosa e a glutamina, pero o efecto é máis forte.A media Z das partículas non se ve afectada, mentres que se detecta un aumento do potencial zeta.O pico de SPR mostrou un lixeiro desprazamento ao vermello, pero quizais o máis interesante é que a intensidade de SPR non diminuíu tan significativamente como na medición de control.Estes resultados poden explicarse pola adsorción innata de macromoléculas na superficie das nanopartículas (fila inferior da Figura 4), que agora se entende como a formación de coroa biomolecular no corpo.49