Javascript je trenutno onemogućen u vašem pregledniku.Kada je javascript onemogućen, neke funkcije ove web stranice neće raditi.
Registrirajte svoje specifične pojedinosti i određene lijekove koji vas zanimaju, a mi ćemo spojiti informacije koje navedete s člancima u našoj opsežnoj bazi podataka i poslati vam PDF kopiju putem e-pošte na vrijeme.
Jesu li manje nanočestice uvijek bolje?Razumijevanje bioloških učinaka agregacije nanočestica srebra ovisne o veličini u biološki relevantnim uvjetima
Autori: Bélteky P, Rónavári A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Kónya Z
Péter Bélteky,1,* Andrea Rónavári,1,* Dalma Zakupszky,1 Eszter Boka,1 Nóra Igaz,2 Bettina Szerencsés,3 Ilona Pfeiffer,3 Csaba Vágvölgyi,3 Mónika Kiricsi iz kemije okoliša, Mađarska, Mađarska Fakultet znanosti i informatike , Sveučilište u Szegedu;2 Zavod za biokemiju i molekularnu biologiju, Fakultet znanosti i informacija, Sveučilište u Szegedu, Mađarska;3 Zavod za mikrobiologiju, Fakultet znanosti i informacija, Sveučilište u Szegedu, Mađarska;4MTA-SZTE Reaction Kinetics and Surface Chemistry Research Group, Szeged, Mađarska* Ovi su autori jednako pridonijeli ovom radu.Komunikacija: Zoltán Kónya Zavod za primijenjenu kemiju i kemiju okoliša, Fakultet znanosti i informatike, Sveučilište u Szegedu, Rerrich Square 1, Szeged, H-6720, Mađarska Telefon +36 62 544620 E-pošta [Zaštita e-pošte] Svrha: Nanočestice srebra (AgNP) su jedan od najčešće proučavanih nanomaterijala, posebice zbog njihove biomedicinske primjene.Međutim, zbog agregacije nanočestica, njihova izvrsna citotoksičnost i antibakterijsko djelovanje često su ugroženi u biološkim medijima.U ovom radu proučavano je agregacijsko ponašanje i povezane biološke aktivnosti tri različita uzorka nanočestica srebra s citratnim završetkom s prosječnim promjerom od 10, 20 i 50 nm.Metoda: Koristite transmisijski elektronski mikroskop za sintetiziranje i karakterizaciju nanočestica, procjenu njihovog agregacijskog ponašanja pri različitim pH vrijednostima, koncentracijama NaCl, glukoze i glutamina dinamičkim raspršenjem svjetlosti i ultraljubičasto-vidljivom spektroskopijom.Osim toga, u mediju stanične kulture komponente kao što je Dulbecco poboljšavaju ponašanje agregacije u Eagle Medijumu i fetalnom telećem serumu.Rezultati: Rezultati pokazuju da kiseli pH i fiziološki sadržaj elektrolita općenito induciraju agregaciju mikronskih razmjera, koja može biti posredovana stvaranjem biomolekularne korone.Vrijedno je napomenuti da veće čestice pokazuju veću otpornost na vanjske utjecaje od svojih manjih čestica.In vitro testovi citotoksičnosti i antibakterijski testovi su provedeni tretiranjem stanica agregatima nanočestica u različitim stadijima agregacije.Zaključak: Naši rezultati otkrivaju duboku korelaciju između koloidne stabilnosti i toksičnosti AgNPs, budući da ekstremna agregacija dovodi do potpunog gubitka biološke aktivnosti.Viši stupanj antiagregacije uočen za veće čestice ima značajan utjecaj na in vitro toksičnost, jer takvi uzorci zadržavaju više antimikrobne aktivnosti i aktivnosti stanica sisavaca.Ovi nalazi dovode do zaključka da, unatoč općem mišljenju u relevantnoj literaturi, ciljanje na najmanje moguće nanočestice možda nije najbolji način djelovanja.Ključne riječi: rast posredovan sjemenom, koloidna stabilnost, agregacijsko ponašanje ovisno o veličini, toksičnost oštećenja agregacije
Kako potražnja i proizvodnja nanomaterijala nastavljaju rasti, sve se više pažnje posvećuje njihovoj biološkoj sigurnosti ili biološkoj aktivnosti.Nanočestice srebra (AgNP) jedan su od najčešće sintetiziranih, istraživanih i korištenih predstavnika ove klase materijala zbog svojih izvrsnih katalitičkih, optičkih i bioloških svojstava.1 Općenito se vjeruje da se jedinstvene karakteristike nanomaterijala (uključujući AgNP) uglavnom pripisuju njihovoj velikoj specifičnoj površini.Stoga je neizbježan problem svaki proces koji utječe na ovu ključnu značajku, kao što je veličina čestica, površinski premaz ili agregacija, hoće li ozbiljno oštetiti svojstva nanočestica koja su kritična za specifične primjene.
Učinci veličine čestica i stabilizatora su teme koje su relativno dobro dokumentirane u literaturi.Na primjer, općeprihvaćeno stajalište je da su manje nanočestice otrovnije od većih nanočestica.2 U skladu s općom literaturom, naše prethodne studije pokazale su djelovanje nanosrebra na stanice sisavaca i mikroorganizme ovisno o veličini.3–5 Površinski premaz još je jedan atribut koji ima veliki utjecaj na svojstva nanomaterijala.Samim dodavanjem ili modificiranjem stabilizatora na svojoj površini, isti nanomaterijal može imati potpuno drugačija fizikalna, kemijska i biološka svojstva.Primjena sredstava za zatvaranje najčešće se izvodi u sklopu sinteze nanočestica.Na primjer, nanočestice srebra s citratnim završetkom jedne su od najrelevantnijih AgNP-ova u istraživanju, koje se sintetiziraju redukcijom soli srebra u odabranoj otopini stabilizatora kao reakcijskom mediju.6 Citrat može lako iskoristiti svoju nisku cijenu, dostupnost, biokompatibilnost i snažan afinitet za srebro, što se može odraziti u različitim predloženim interakcijama, od reverzibilne površinske adsorpcije do ionskih interakcija.Male molekule i poliatomski ioni blizu 7,8, kao što su citrati, polimeri, polielektroliti i biološki agensi također se često koriste za stabilizaciju nano-srebra i izvođenje jedinstvenih funkcionalizacija na njemu.9-12 (prikaz, ostalo).
Iako je mogućnost mijenjanja aktivnosti nanočestica namjernim pokrivanjem površine vrlo zanimljivo područje, glavna uloga ove površinske prevlake je zanemariva, osiguravajući koloidnu stabilnost za sustav nanočestica.Velika specifična površina nanomaterijala proizvest će veliku površinsku energiju, što sprječava termodinamičku sposobnost sustava da postigne svoju minimalnu energiju.13 Bez odgovarajuće stabilizacije, to može dovesti do aglomeracije nanomaterijala.Agregacija je stvaranje agregata čestica različitih oblika i veličina koje se događa kada se raspršene čestice susretnu, a trenutne termodinamičke interakcije omogućuju česticama da prianjaju jedna uz drugu.Stoga se stabilizatori koriste za sprječavanje agregacije uvođenjem dovoljno velike odbojne sile između čestica da se suprotstavi njihovom termodinamičkom privlačenju.14
Iako je tema veličine čestica i površinske pokrivenosti temeljito istražena u kontekstu njezine regulacije bioloških aktivnosti potaknutih nanočesticama, agregacija čestica je uvelike zanemareno područje.Gotovo da nema temeljite studije za rješavanje koloidne stabilnosti nanočestica u biološki relevantnim uvjetima.10,15-17 Osim toga, ovaj doprinos je posebno rijedak, gdje je toksičnost povezana s agregacijom također proučavana, čak i ako može uzrokovati nuspojave, kao što je vaskularna tromboza, ili gubitak željenih karakteristika, kao što je njegova toksičnost, kao prikazano na slici 1.18, 19 prikazano.Zapravo, jedan od rijetkih poznatih mehanizama otpornosti na nanočestice srebra povezan je s agregacijom, jer se izvješćuje da određeni sojevi E. coli i Pseudomonas aeruginosa smanjuju svoju osjetljivost na nano-srebro ekspresijom proteina flagelina, flagellina.Ima visok afinitet prema srebru, čime potiče agregaciju.20
Postoji nekoliko različitih mehanizama povezanih s toksičnošću nanočestica srebra, a agregacija utječe na sve te mehanizme.Metoda biološke aktivnosti AgNP o kojoj se najviše raspravlja, koja se ponekad naziva i mehanizam "trojanskog konja", smatra AgNP nositeljima Ag+.1,21 Mehanizam trojanskog konja može osigurati veliki porast lokalne koncentracije Ag+, što dovodi do stvaranja ROS i depolarizacije membrane.22-24 Agregacija može utjecati na oslobađanje Ag+, čime utječe na toksičnost, jer smanjuje učinkovitu aktivnu površinu na kojoj se ioni srebra mogu oksidirati i otopiti.Međutim, AgNP-ovi neće pokazati toksičnost samo kroz otpuštanje iona.Moraju se uzeti u obzir mnoge interakcije povezane s veličinom i morfologijom.Među njima su veličina i oblik površine nanočestica ključne karakteristike.4,25 Skup ovih mehanizama može se kategorizirati kao "mehanizmi inducirane toksičnosti".Postoje potencijalno mnoge reakcije mitohondrija i površinske membrane koje mogu oštetiti organele i uzrokovati smrt stanice.25-27 Budući da stvaranje agregata prirodno utječe na veličinu i oblik predmeta koji sadrže srebro koje prepoznaju živi sustavi, te interakcije također mogu biti pogođene.
U našem prethodnom radu o agregaciji nanočestica srebra, demonstrirali smo učinkovitu proceduru pregleda koja se sastoji od kemijskih i in vitro bioloških eksperimenata za proučavanje ovog problema.19 Dinamičko raspršenje svjetlosti (DLS) je poželjna tehnika za ove vrste pregleda jer materijal može raspršiti fotone na valnoj duljini usporedivoj s veličinom njegovih čestica.Budući da je brzina Brownovog gibanja čestica u tekućem mediju povezana s veličinom, promjena intenziteta raspršene svjetlosti može se koristiti za određivanje prosječnog hidrodinamičkog promjera (Z-srednja vrijednost) tekućeg uzorka.28 Osim toga, primjenom napona na uzorak, zeta potencijal (ζ potencijal) nanočestice može se izmjeriti slično Z prosječnoj vrijednosti.13,28 Ako je apsolutna vrijednost zeta potencijala dovoljno visoka (prema općim smjernicama> ±30 mV), to će generirati snažno elektrostatsko odbijanje između čestica kako bi se spriječilo nakupljanje.Karakteristična površinska plazmonska rezonancija (SPR) je jedinstveni optički fenomen koji se uglavnom pripisuje nanočesticama plemenitih metala (uglavnom Au i Ag).29​​ Na temelju elektroničkih oscilacija (površinskih plazmona) ovih materijala na nanoskali, poznato je da sferični AgNP imaju karakterističan UV-Vis apsorpcijski maksimum blizu 400 nm.30 Intenzitet i pomak valne duljine čestica koriste se kao dopuna DLS rezultatima, budući da se ova metoda može koristiti za otkrivanje agregacije nanočestica i površinske adsorpcije biomolekula.
Na temelju dobivenih informacija, provode se testovi viabilnosti stanica (MTT) i antibakterijski testovi na način da se toksičnost AgNP opisuje kao funkcija razine agregacije, a ne (najčešće korištenog faktora) koncentracije nanočestica.Ova jedinstvena metoda omogućuje nam da pokažemo duboku važnost razine agregacije u biološkoj aktivnosti, jer, na primjer, AgNP s citratom potpuno gube svoju biološku aktivnost unutar nekoliko sati zbog agregacije.19
U trenutnom radu, cilj nam je uvelike proširiti naše prethodne doprinose stabilnosti koloida povezanih s biološkom i njihov utjecaj na biološku aktivnost proučavanjem učinka veličine nanočestica na agregaciju nanočestica.Ovo je nedvojbeno jedno od istraživanja nanočestica.Perspektiva višeg profila i 31 Kako bi se istražio ovaj problem, korištena je metoda rasta posredovana sjemenom za proizvodnju AgNP s citratom u tri različita raspona veličina (10, 20 i 50 nm).6,32 kao jedna od najčešćih metoda.Za nanomaterijale koji se naširoko i rutinski koriste u medicinskim primjenama, odabrani su AgNP-ovi s citratnim završetkom različitih veličina kako bi se proučila moguća ovisnost o veličini bioloških svojstava nanosrebra povezanih s agregacijom.Nakon sintetiziranja AgNP-ova različitih veličina, okarakterizirali smo proizvedene uzorke transmisijskom elektronskom mikroskopijom (TEM), a zatim ispitali čestice koristeći gore spomenuti postupak skrininga.Osim toga, u prisutnosti in vitro staničnih kultura Dulbecco modificiranog Eagleovog medija (DMEM) i fetalnog goveđeg seruma (FBS), ponašanje agregacije ovisno o veličini i njeno ponašanje procijenjeno je pri različitim pH vrijednostima, koncentracijama NaCl, glukoze i glutamina.Karakteristike citotoksičnosti određuju se pod sveobuhvatnim uvjetima.Znanstveni konsenzus ukazuje da su manje čestice općenito poželjnije;naše istraživanje pruža kemijsku i biološku platformu za utvrđivanje je li to slučaj.
Tri nanočestice srebra s različitim rasponima veličina pripremljene su metodom rasta posredovane sjemenkama koju su predložili Wan i sur., uz male prilagodbe.6 Ova se metoda temelji na kemijskoj redukciji, koristeći srebrov nitrat (AgNO3) kao izvor srebra, natrijev borohidrid (NaBH4) kao redukcijsko sredstvo i natrijev citrat kao stabilizator.Prvo pripremite 75 mL 9 mM vodene otopine citrata iz natrijevog citrat dihidrata (Na3C6H5O7 x 2H2O) i zagrijte na 70°C.Zatim je u reakcijski medij dodano 2 mL 1% w/v otopine AgNO3, a zatim je svježe pripremljena otopina natrijevog borohidrida (2 mL 0,1% w/v) ukapana u smjesu.Rezultirajuća žuto-smeđa suspenzija držana je na 70°C uz snažno miješanje 1 sat, a zatim ohlađena na sobnu temperaturu.Rezultirajući uzorak (koji se od sada naziva AgNP-I) koristi se kao osnova za rast posredovan sjemenom u sljedećem koraku sinteze.
Za sintetiziranje suspenzije čestica srednje veličine (označene kao AgNP-II), zagrijte 90 mL 7,6 mM otopine citrata na 80°C, pomiješajte je s 10 mL AgNP-I, a zatim pomiješajte 2 mL 1% w/v otopine AgNO3 držan je pod snažnim mehaničkim miješanjem 1 sat, a zatim je uzorak ohlađen na sobnu temperaturu.
Za najveću česticu (AgNP-III), ponovite isti proces rasta, ali u ovom slučaju koristite 10 mL AgNP-II kao suspenziju sjemena.Nakon što uzorci dostignu sobnu temperaturu, postavljaju svoju nominalnu koncentraciju Ag na temelju ukupnog sadržaja AgNO3 na 150 ppm dodavanjem ili isparavanjem dodatnog otapala na 40°C, te ih na kraju pohranjuju na 4°C do daljnje uporabe.
Upotrijebite FEI Tecnai G2 20 X-Twin transmisijski elektronski mikroskop (TEM) (FEI korporativno sjedište, Hillsboro, Oregon, SAD) s naponom ubrzanja od 200 kV za ispitivanje morfoloških karakteristika nanočestica i snimanje uzorka njihove difrakcije elektrona (ED).Najmanje 15 reprezentativnih slika (~750 čestica) procijenjeno je pomoću softverskog paketa ImageJ, a dobiveni histogrami (i svi grafikoni u cijeloj studiji) izrađeni su u OriginPro 2018 (OriginLab, Northampton, MA, SAD) 33, 34.
Prosječni hidrodinamički promjer (Z-prosjek), zeta potencijal (ζ-potencijal) i karakteristična površinska plazmonska rezonancija (SPR) uzoraka izmjereni su kako bi se ilustrirala njihova početna koloidna svojstva.Prosječni hidrodinamički promjer i zeta potencijal uzorka izmjereni su instrumentom Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, Ujedinjeno Kraljevstvo) korištenjem presavijenih kapilarnih ćelija za jednokratnu upotrebu na 37±0,1°C.UV-Vis spektrofotometar Ocean Optics 355 DH-2000-BAL (Halma PLC, Largo, FL, SAD) korišten je za dobivanje karakterističnih SPR karakteristika iz UV-Vis apsorpcijskih spektara uzoraka u rasponu od 250-800 nm.
Tijekom cijelog eksperimenta istovremeno su provedena tri različita tipa mjerenja vezana uz koloidnu stabilnost.Koristite DLS za mjerenje prosječnog hidrodinamičkog promjera (Z prosjek) i zeta potencijala (ζ potencijal) čestica, jer je Z prosjek povezan s prosječnom veličinom agregata nanočestica, a zeta potencijal pokazuje je li elektrostatsko odbijanje u sustavu je dovoljno jak da neutralizira Van der Waalsovo privlačenje između nanočestica.Mjerenja su napravljena u tri primjerka, a standardna devijacija Z srednje vrijednosti i zeta potencijala izračunata je softverom Zetasizer.Karakteristični SPR spektri čestica procjenjuju se UV-Vis spektroskopijom, jer promjene u vršnom intenzitetu i valnoj duljini mogu ukazivati ​​na agregaciju i površinske interakcije.29,35 Zapravo, površinska plazmonska rezonancija u plemenitim metalima toliko je utjecajna da je dovela do novih metoda analize biomolekula.29,36,37 Koncentracija AgNP u eksperimentalnoj smjesi je oko 10 ppm, a svrha je postaviti intenzitet maksimalne početne SPR apsorpcije na 1. Eksperiment je proveden na vremenski ovisan način na 0;1,5;3;6;12 i 24 sata pod različitim biološki relevantnim uvjetima.Više detalja koji opisuju eksperiment mogu se vidjeti u našem prethodnom radu.19 Ukratko, različite pH vrijednosti (3; 5; 7,2 i 9), različite koncentracije natrijevog klorida (10 mM; 50 mM; 150 mM), glukoze (3,9 mM; 6,7 mM) i glutamina (4 mM) i također su pripremili Dulbeccov modificirani Eagle Medium (DMEM) i fetalni goveđi serum (FBS) (u vodi i DMEM) kao modelne sustave i proučavali njihove učinke na ponašanje agregacije sintetiziranih nanočestica srebra.pH Vrijednosti NaCl, glukoze i glutamina procjenjuju se na temelju fizioloških koncentracija, dok su količine DMEM i FBS iste kao razine korištene u cijelom in vitro eksperimentu.38-42 Sva su mjerenja provedena pri pH 7,2 i 37°C s konstantnom pozadinskom koncentracijom soli od 10 mM NaCl kako bi se eliminirale sve interakcije čestica na velikim udaljenostima (osim za određene pokuse povezane s pH i NaCl, gdje su ti atributi varijable pod studija).28 Popis različitih uvjeta sažet je u tablici 1. Eksperiment označen sa † koristi se kao referenca i odgovara uzorku koji sadrži 10 mM NaCl i pH 7,2.
Ljudska stanična linija raka prostate (DU145) i besmrtni ljudski keratinociti (HaCaT) dobiveni su od ATCC (Manassas, VA, SAD).Stanice se rutinski uzgajaju u Dulbeccovom minimalnom esencijalnom mediju Eagle (DMEM) koji sadrži 4,5 g/L glukoze (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, SAD), dopunjen s 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 0,01% streptomicina i 0,005% Penicilin (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, SAD).Stanice se uzgajaju u inkubatoru na 37°C pod 5% CO2 i 95% vlažnosti.
Kako bi se istražile promjene u citotoksičnosti AgNP uzrokovane agregacijom čestica na način ovisan o vremenu, proveden je MTT test u dva koraka.Prvo je izmjerena održivost dva tipa stanica nakon tretmana s AgNP-I, AgNP-II i AgNP-III.U tu svrhu, dvije vrste stanica su nasađene u ploče s 96 jažica pri gustoći od 10 000 stanica/jažici i tretirane s tri različite veličine nanočestica srebra u sve većim koncentracijama drugog dana.Nakon 24 sata tretmana, stanice su isprane s PBS-om i inkubirane s 0,5 mg/mL MTT reagensa (SERVA, Heidelberg, Njemačka) razrijeđenog u mediju kulture 1 sat na 37°C.Kristali formazana otopljeni su u DMSO (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, SAD), a apsorpcija je izmjerena na 570 nm pomoću Synergy HTX čitača ploča (BioTek-Mađarska, Budimpešta, Mađarska).Vrijednost apsorpcije netretiranog kontrolnog uzorka smatra se stopom preživljavanja od 100%.Izvedite najmanje 3 pokusa koristeći četiri neovisna biološka ponavljanja.IC50 se izračunava iz krivulje odgovora na dozu na temelju rezultata vitalnosti.
Nakon toga, u drugom koraku, inkubiranjem čestica sa 150 mM NaCl kroz različita vremenska razdoblja (0, 1,5, 3, 6, 12 i 24 sata) prije tretmana stanica, proizvedena su različita agregacijska stanja nanočestica srebra.Zatim je izveden isti MTT test kao što je prethodno opisano da se procijene promjene u staničnoj vitalnosti na koje utječe agregacija čestica.Upotrijebite GraphPad Prism 7 za procjenu konačnog rezultata, izračunajte statističku značajnost eksperimenta neuparenim t-testom i označite njegovu razinu kao * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01), *** (p ≤ 0,001). ) I **** (p ≤ 0,0001).
Tri različite veličine nanočestica srebra (AgNP-I, AgNP-II i AgNP-III) korištene su za antibakterijsku osjetljivost na Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM; Istraživački centar za patogene gljive i mikrobnu toksikologiju, Sveučilište Chiba) i Bacillus Test megaterium SZMC 6031 (SZMC: Szeged Microbiology Collection) i E. coli SZMC 0582 u mediju RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Co.).Kako bi se procijenile promjene u antibakterijskom djelovanju uzrokovane agregacijom čestica, najprije je određena njihova minimalna inhibitorna koncentracija (MIC) mikrodilucijom u mikrotitarskoj ploči s 96 jažica.U 50 μL standardizirane stanične suspenzije (5 × 104 stanica/mL u mediju RPMI 1640) dodajte 50 μL suspenzije nanočestica srebra i serijski razrijedite dva puta koncentraciju (u gore navedenom mediju, raspon je 0 i 75 ppm, tj. kontrolni uzorak sadrži 50 μL stanične suspenzije i 50 μL medija bez nanočestica).Nakon toga, ploča je inkubirana na 30°C 48 sati, a optička gustoća kulture izmjerena je na 620 nm pomoću čitača ploča SPECTROstar Nano (BMG LabTech, Offenburg, Njemačka).Pokus je izveden tri puta u triplikatu.
Osim što je u ovom trenutku korišteno 50 μL pojedinačnih agregiranih uzoraka nanočestica, isti postupak kao što je prethodno opisan korišten je za ispitivanje učinka agregacije na antibakterijsko djelovanje na gore spomenutim sojevima.Različita agregacijska stanja nanočestica srebra proizvode se inkubiranjem čestica sa 150 mM NaCl tijekom različitih vremenskih razdoblja (0, 1,5, 3, 6, 12 i 24 sata) prije obrade stanica.Kao kontrola rasta korištena je suspenzija dopunjena s 50 μL medija RPMI 1640, dok je za kontrolu toksičnosti korištena suspenzija s neagregiranim nanočesticama.Pokus je izveden tri puta u triplikatu.Upotrijebite GraphPad Prism 7 za ponovnu procjenu konačnog rezultata, koristeći istu statističku analizu kao MTT analiza.
Karakterizirana je razina agregacije najsitnijih čestica (AgNP-I), a rezultati su djelomično objavljeni u našim prethodnim radovima, no radi bolje usporedbe sve su čestice temeljito pregledane.Eksperimentalni podaci prikupljaju se i raspravljaju u sljedećim odjeljcima.Tri veličine AgNP.19
Mjerenja provedena pomoću TEM, UV-Vis i DLS potvrdila su uspješnu sintezu svih uzoraka AgNP (Slika 2A-D).Prema prvom redu slike 2, najmanja čestica (AgNP-I) pokazuje ujednačenu sferičnu morfologiju s prosječnim promjerom od oko 10 nm.Metoda rasta posredovana sjemenom također osigurava AgNP-II i AgNP-III s različitim rasponima veličina s prosječnim promjerom čestica od približno 20 nm odnosno 50 nm.Prema standardnoj devijaciji raspodjele čestica, veličine triju uzoraka se ne preklapaju, što je važno za njihovu usporednu analizu.Usporedbom prosječnog omjera širine i visine slike i omjera tankosti 2D projekcija čestica temeljenih na TEM-u, pretpostavlja se da se sferičnost čestica procjenjuje ImageJ-ovim dodatkom filtera oblika (Slika 2E).43 Prema analizi oblika čestica, njihov omjer širine i visine (velika stranica/kraća stranica najmanjeg graničnog pravokutnika) nije pod utjecajem rasta čestice, a njihov omjer tankosti (izmjerena površina odgovarajućeg savršenog kruga/teorijska površina ) postupno se smanjuje.To rezultira sve više i više poliedarskih čestica, koje su u teoriji savršeno okrugle, što odgovara omjeru tankosti od 1.
Slika 2 Slika transmisijskog elektronskog mikroskopa (TEM) (A), uzorak elektronske difrakcije (ED) (B), histogram raspodjele veličine (C), karakteristični ultraljubičasto vidljiv (UV-Vis) spektar apsorpcije svjetlosti (D) i prosječni tekući citrat -terminirane nanočestice srebra s mehaničkim promjerom (Z-prosjek), zeta potencijalom, omjerom stranica i omjerom debljine (E) imaju tri različita raspona veličina: AgNP-I je 10 nm (gornji red), AgNP -II je 20 nm (srednji red) ), AgNP-III (donji red) je 50 nm.
Iako je ciklička priroda metode rasta u određenoj mjeri utjecala na oblik čestice, što je rezultiralo manjom sferičnošću većih AgNP-ova, sva tri uzorka ostala su kvazi-sferična.Osim toga, kao što je prikazano na uzorku difrakcije elektrona na slici 2B, nanokristalnost čestica nije pogođena.Istaknuti difrakcijski prsten - koji se može povezati s (111), (220), (200) i (311) Millerovim indeksima srebra - vrlo je u skladu sa znanstvenom literaturom i našim prethodnim doprinosima.9, 19,44 Fragmentacija Debye-Scherrerovog prstena AgNP-II i AgNP-III posljedica je činjenice da je ED slika snimljena pri istom povećanju, pa kako se veličina čestica povećava, broj difraktiranih čestica po jedinična površina se povećava i smanjuje .
Poznato je da veličina i oblik nanočestica utječu na biološku aktivnost.3,45 Katalitička i biološka aktivnost ovisna o obliku može se objasniti činjenicom da različiti oblici teže proliferaciji određenih kristalnih površina (s različitim Millerovim indeksima), a te kristalne površine imaju različite aktivnosti.45,46 Budući da pripremljene čestice daju slične ED rezultate koji odgovaraju vrlo sličnim karakteristikama kristala, može se pretpostaviti da bi se u našim kasnijim eksperimentima koloidne stabilnosti i biološke aktivnosti sve uočene razlike trebale pripisati veličini nanočestica, a ne svojstvima povezanim s oblikom.
UV-Vis rezultati sažeti na slici 2D dodatno naglašavaju neodoljivu sferičnu prirodu sintetiziranog AgNP, jer su vrhovi SPR sva tri uzorka oko 400 nm, što je karakteristična vrijednost za sferne nanočestice srebra.29,30 Snimljeni spektri također su potvrdili uspješan rast nanosrebra posredovan sjemenkama.Kako se veličina čestice povećava, valna duljina koja odgovara maksimalnoj apsorpciji svjetla AgNP-II-više je izražena-Prema literaturi, AgNP-III je doživio crveni pomak.6,29
Što se tiče početne koloidne stabilnosti AgNP sustava, DLS je korišten za mjerenje prosječnog hidrodinamičkog promjera i zeta potencijala čestica pri pH 7,2.Rezultati prikazani na slici 2E pokazuju da AgNP-III ima veću koloidalnu stabilnost od AgNP-I ili AgNP-II, jer uobičajene smjernice pokazuju da je zeta potencijal od 30 mV apsolutno neophodan za dugoročnu koloidalnu stabilnost. Ovaj nalaz je dodatno podržan kada prosječna vrijednost Z (dobivena kao prosječni hidrodinamički promjer slobodnih i agregiranih čestica) uspoređuje se s primarnom veličinom čestica dobivenom TEM-om, jer što su te dvije vrijednosti bliže, to je stupanj skupljanja u uzorku blaži.Zapravo, Z prosjek za AgNP-I i AgNP-II je razumno veći od njihove glavne veličine čestica procijenjene TEM-om, pa se u usporedbi s AgNP-III predviđa veća vjerojatnost agregacije ovih uzoraka, gdje je vrlo negativan zeta potencijal je popraćen bliskom veličinom Z prosječne vrijednosti.
Objašnjenje ovog fenomena može biti dvojako.S jedne strane, koncentracija citrata održava se na sličnoj razini u svim koracima sinteze, osiguravajući relativno visoku količinu nabijenih površinskih skupina kako bi se spriječilo smanjenje specifične površine rastućih čestica.Međutim, prema Levaku i dr., male molekule poput citrata mogu se lako zamijeniti biomolekulama na površini nanočestica.U ovom slučaju, koloidna stabilnost će biti određena koronom proizvedenih biomolekula.31 Budući da je ovo ponašanje također primijećeno u našim mjerenjima agregacije (o čemu se detaljnije raspravlja kasnije), samo ograničavanje citrata ne može objasniti ovaj fenomen.
S druge strane, veličina čestica je obrnuto proporcionalna tendenciji agregacije na nanometarskoj razini.Ovo je uglavnom podržano tradicionalnom metodom Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO), gdje se privlačenje čestica opisuje kao zbroj privlačnih i odbojnih sila između čestica.Prema He et al., maksimalna vrijednost krivulje energije DLVO opada s veličinom nanočestica u nanočesticama hematita, što olakšava postizanje minimalne primarne energije, čime se potiče ireverzibilna agregacija (kondenzacija).47 Međutim, nagađa se da postoje i drugi aspekti izvan ograničenja DLVO teorije.Iako su van der Waalsova gravitacija i elektrostatsko odbijanje dvostrukog sloja slični s povećanjem veličine čestica, pregled Hotze et al.predlaže da ima jači učinak na agregaciju nego što DLVO dopušta.14 Oni vjeruju da se površinska zakrivljenost nanočestica više ne može procijeniti kao ravna površina, što matematičku procjenu čini neprimjenjivom.Osim toga, kako se veličina čestica smanjuje, postotak atoma prisutnih na površini postaje veći, što dovodi do elektroničke strukture i ponašanja površinskog naboja.I površinska reaktivnost se mijenja, što može dovesti do smanjenja naboja u dvostrukom električnom sloju i potaknuti agregaciju.
Uspoređujući DLS rezultate AgNP-I, AgNP-II i AgNP-III na slici 3, primijetili smo da sva tri uzorka pokazuju sličnu pH vrijednost koja potiče agregaciju.Jako kiselo okruženje (pH 3) pomiče zeta potencijal uzorka na 0 mV, uzrokujući da čestice tvore agregate mikronske veličine, dok alkalni pH pomiče svoj zeta potencijal na veću negativnu vrijednost, gdje čestice tvore manje agregate (pH 5 ).I 7.2) ), ili ostaju potpuno neagregirani (pH 9).Uočene su i neke važne razlike između različitih uzoraka.Tijekom cijelog eksperimenta pokazalo se da je AgNP-I najosjetljiviji na pH-inducirane promjene zeta potencijala, jer je zeta potencijal ovih čestica smanjen na pH 7,2 u usporedbi s pH 9, dok su AgNP-II i AgNP-III pokazali samo A značajna promjena u ζ je oko pH 3. Osim toga, AgNP-II je pokazao sporije promjene i umjeren zeta potencijal, dok je AgNP-III pokazao najblaže ponašanje od ta tri, jer je sustav pokazao najveću apsolutnu zeta vrijednost i sporo kretanje trenda, što ukazuje AgNP-III Najotporniji na pH-induciranu agregaciju.Ovi rezultati su u skladu s rezultatima mjerenja prosječnog hidrodinamičkog promjera.Uzimajući u obzir veličinu čestica njihovih primera, AgNP-I pokazao je stalnu postupnu agregaciju pri svim pH vrijednostima, najvjerojatnije zbog pozadine od 10 mM NaCl, dok su AgNP-II i AgNP-III pokazali značajnu samo pri pH 3 skupljanja.Najzanimljivija razlika je u tome što unatoč velikoj veličini nanočestica, AgNP-III stvara najmanje agregate pri pH 3 u 24 sata, ističući njegova svojstva protiv agregacije.Dijeljenjem prosječnog Z AgNP-a pri pH 3 nakon 24 sata s vrijednošću pripremljenog uzorka, može se uočiti da su se relativne veličine agregata AgNP-I i AgNP-II povećale 50 puta, 42 puta i 22 puta , odnosno.III.
Slika 3 Rezultati dinamičkog raspršenja svjetlosti uzorka nanočestica srebra s citratnim završetkom s povećanjem veličine (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II i 50 nm: AgNP-III) izraženi su kao prosječni hidrodinamički promjer (Z prosjek ) (desno) Pod različitim pH uvjetima, zeta potencijal (lijevo) se mijenja unutar 24 sata.
Opažena agregacija ovisna o pH također je utjecala na karakterističnu površinsku plazmonsku rezonanciju (SPR) uzoraka AgNP, što je dokazano njihovim UV-Vis spektrom.Prema dodatnoj slici S1, agregacija sve tri suspenzije nanočestica srebra praćena je smanjenjem intenziteta njihovih SPR vrhova i umjerenim crvenim pomakom.Opseg ovih promjena kao funkcija pH konzistentan je sa stupnjem agregacije predviđenim rezultatima DLS, međutim, uočeni su neki zanimljivi trendovi.Suprotno intuiciji, pokazalo se da je AgNP-II srednje veličine najosjetljiviji na SPR promjene, dok su druga dva uzorka manje osjetljiva.U istraživanju SPR-a, 50 nm je teorijska granica veličine čestica, koja se koristi za razlikovanje čestica na temelju njihovih dielektričnih svojstava.Čestice manje od 50 nm (AgNP-I i AgNP-II) mogu se opisati kao jednostavni dielektrični dipoli, dok čestice koje dosežu ili prelaze ovu granicu (AgNP-III) imaju složenija dielektrična svojstva, a njihova rezonancija pojas se dijeli na multimodalne promjene .U slučaju dva manja uzorka čestica, AgNP se mogu smatrati jednostavnim dipolima, a plazma se lako može preklapati.Kako se veličina čestica povećava, ovo spajanje u biti proizvodi veću plazmu, što može objasniti uočenu veću osjetljivost.29 Međutim, za najveće čestice jednostavna procjena dipola nije valjana kada se mogu pojaviti i druga stanja sprezanja, što može objasniti smanjenu tendenciju AgNP-III da ukazuje na spektralne promjene.29
Pod našim eksperimentalnim uvjetima, dokazano je da pH vrijednost ima dubok učinak na koloidalnu stabilnost nanočestica srebra obloženih citratom različitih veličina.U tim sustavima stabilnost osiguravaju negativno nabijene -COO- skupine na površini AgNP.Karboksilatna funkcionalna skupina citratnog iona protonirana je u velikom broju H+ iona, tako da stvorena karboksilna skupina više ne može osigurati elektrostatsko odbijanje između čestica, kao što je prikazano u gornjem redu slike 4. Prema Le Chatelierovom principu, AgNP uzorci se brzo agregiraju pri pH 3, ali postupno postaju sve stabilniji kako se pH povećava.
Slika 4. Shematski mehanizam površinske interakcije definiran agregacijom pod različitim pH (gornji red), koncentracijom NaCl (srednji red) i biomolekulama (donji red).
Prema slici 5, koloidna stabilnost u suspenzijama AgNP različitih veličina također je ispitana pri rastućim koncentracijama soli.Na temelju zeta potencijala, povećana veličina nanočestica u tim AgNP sustavima s citratnim završetkom ponovno pruža povećanu otpornost na vanjske utjecaje NaCl.U AgNP-I, 10 mM NaCl je dovoljno da izazove blagu agregaciju, a koncentracija soli od 50 mM daje vrlo slične rezultate.U AgNP-II i AgNP-III, 10 mM NaCl ne utječe značajno na zeta potencijal jer njihove vrijednosti ostaju na (AgNP-II) ili ispod (AgNP-III) -30 mV.Povećanje koncentracije NaCl na 50 mM i konačno na 150 mM NaCl dovoljno je da značajno smanji apsolutnu vrijednost zeta potencijala u svim uzorcima, iako veće čestice zadržavaju više negativnog naboja.Ovi su rezultati u skladu s očekivanim prosječnim hidrodinamičkim promjerom AgNP-ova;linije Z prosjeka trenda izmjerene na 10, 50 i 150 mM NaCl pokazuju različite, postupno rastuće vrijednosti.Konačno, agregati mikronske veličine otkriveni su u sva tri pokusa od 150 mM.
Slika 5 Rezultati dinamičkog raspršenja svjetlosti uzorka nanočestica srebra s citratnim završetkom s povećanjem veličine (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II i 50 nm: AgNP-III) izraženi su kao prosječni hidrodinamički promjer (Z prosjek ) (desno) i zeta potencijal (lijevo) mijenjaju se unutar 24 sata pod različitim koncentracijama NaCl.
UV-Vis rezultati na Dodatnoj slici S2 pokazuju da SPR od 50 i 150 mM NaCl u sva tri uzorka ima trenutno i značajno smanjenje.To se može objasniti pomoću DLS-a, jer se agregacija na bazi NaCl događa brže od pokusa ovisnih o pH, što se objašnjava velikom razlikom između ranih (0, 1,5 i 3 sata) mjerenja.Osim toga, povećanje koncentracije soli također će povećati relativnu permitivnost eksperimentalnog medija, što će imati dubok učinak na rezonanciju površinskog plazmona.29
Učinak NaCl sažet je u srednjem redu slike 4. Općenito se može zaključiti da povećanje koncentracije natrijevog klorida ima sličan učinak kao povećanje kiselosti, jer ioni Na+ imaju tendenciju koordiniranja oko karboksilatnih skupina, potiskujući AgNP s negativnim zeta potencijalom.Osim toga, 150 mM NaCl proizvelo je mikronske agregate u sva tri uzorka, što ukazuje da je fiziološka koncentracija elektrolita štetna za koloidnu stabilnost AgNP-ova s ​​citratnim završetkom.Uzimajući u obzir kritičnu koncentraciju kondenzacije (CCC) NaCl na sličnim AgNP sustavima, ovi se rezultati mogu pametno smjestiti u relevantnu literaturu.Huynh i sur.izračunali su da je CCC NaCl za nanočestice srebra s citratnim završetkom s prosječnim promjerom od 71 nm 47,6 mM, dok su El Badawy i sur.primijetili su da je CCC 10 nm AgNP s citratnom prevlakom 70 mM.10,16 Osim toga, značajno visok CCC od oko 300 mM izmjerili su He i sur., što je uzrokovalo da se njihova metoda sinteze razlikuje od prethodno spomenute publikacije.48 Iako trenutni doprinos nije usmjeren na sveobuhvatnu analizu ovih vrijednosti, jer naši eksperimentalni uvjeti postaju sve složeniji u cijeloj studiji, biološki relevantna koncentracija NaCl od 50 mM, posebno 150 mM NaCl, čini se dosta visokom.Inducirana koagulacija, objašnjavajući otkrivene jake promjene.
Sljedeći korak u eksperimentu polimerizacije je korištenje jednostavnih, ali biološki relevantnih molekula za simulaciju interakcija nanočestica i biomolekula.Na temelju DLS (slike 6 i 7) i UV-Vis rezultata (dopunske slike S3 i S4), mogu se iznijeti neki opći zaključci.Pod našim eksperimentalnim uvjetima, proučavane molekule glukoze i glutamina neće inducirati agregaciju ni u jednom AgNP sustavu, jer je trend Z-srednje vrijednosti usko povezan s odgovarajućom referentnom mjernom vrijednošću.Iako njihova prisutnost ne utječe na agregaciju, eksperimentalni rezultati pokazuju da su te molekule djelomično adsorbirane na površini AgNP.Najistaknutiji rezultat koji podupire ovo gledište je opažena promjena u apsorpciji svjetla.Iako AgNP-I ne pokazuje značajne promjene valne duljine ili intenziteta, može se jasnije uočiti mjerenjem većih čestica, što je najvjerojatnije zbog ranije spomenute veće optičke osjetljivosti.Bez obzira na koncentraciju, glukoza može uzrokovati veći crveni pomak nakon 1,5 sata u usporedbi s kontrolnim mjerenjem, koje iznosi oko 40 nm u AgNP-II i oko 10 nm u AgNP-III, što dokazuje pojavu površinskih interakcija.Glutamin je pokazao sličan trend, ali promjena nije bila toliko očita.Osim toga, također je vrijedno spomenuti da glutamin može smanjiti apsolutni zeta potencijal srednjih i velikih čestica.Međutim, budući da se čini da te zeta promjene ne utječu na razinu agregacije, može se nagađati da čak i male biomolekule poput glutamina mogu pružiti određeni stupanj prostornog odbijanja između čestica.
Slika 6 Rezultati dinamičkog raspršenja svjetlosti uzoraka nanočestica srebra s citratnim završetkom s povećanjem veličine (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II i 50 nm: AgNP-III) izraženi su kao prosječni hidrodinamički promjer (Z prosjek) (desno) Pod vanjskim uvjetima različitih koncentracija glukoze, zeta potencijal (lijevo) se mijenja unutar 24 sata.
Slika 7 Rezultati dinamičkog raspršenja svjetlosti uzorka nanočestica srebra s citratnim završetkom s povećanjem veličine (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II i 50 nm: AgNP-III) izraženi su kao prosječni hidrodinamički promjer (Z prosjek ) (desno) U prisutnosti glutamina, zeta potencijal (lijevo) se mijenja unutar 24 sata.
Ukratko, male biomolekule poput glukoze i glutamina ne utječu na stabilnost koloida pri izmjerenoj koncentraciji: iako u različitim stupnjevima utječu na zeta potencijal i UV-Vis rezultate, Z prosječni rezultati nisu dosljedni.To ukazuje da površinska adsorpcija molekula inhibira elektrostatsko odbijanje, ali u isto vrijeme osigurava dimenzionalnu stabilnost.
Kako bismo povezali prethodne rezultate s prijašnjim i vještije simulirali biološke uvjete, odabrali smo neke od najčešće korištenih komponenti stanične kulture i upotrijebili ih kao eksperimentalne uvjete za proučavanje stabilnosti AgNP koloida.U cijelom in vitro eksperimentu, jedna od najvažnijih funkcija DMEM-a kao medija je uspostavljanje potrebnih osmotskih uvjeta, ali s kemijskog gledišta, to je kompleksna otopina soli ukupne ionske jakosti slične 150 mM NaCl .40 Što se tiče FBS-a, to je složena mješavina biomolekula-uglavnom proteina-sa gledišta površinske adsorpcije, ima neke sličnosti s eksperimentalnim rezultatima glukoze i glutamina, unatoč kemijskom sastavu i raznolikosti Spol je puno kompliciraniji.19 DLS i UV-Vidljivi rezultati prikazani na slici 8 i dodatnoj slici S5 mogu se objasniti ispitivanjem kemijskog sastava ovih materijala i njihovim povezivanjem s mjerenjima u prethodnom odjeljku.
Slika 8 Rezultati dinamičkog raspršenja svjetlosti uzorka nanočestica srebra s citratnim završetkom s povećanjem veličine (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II i 50 nm: AgNP-III) izraženi su kao prosječni hidrodinamički promjer (Z prosjek ) (desno) U prisutnosti komponenti stanične kulture DMEM i FBS, zeta potencijal (lijevo) se mijenja unutar 24 sata.
Razrjeđivanje AgNP-ova različitih veličina u DMEM-u ima sličan učinak na stabilnost koloida kao onaj opažen u prisutnosti visokih koncentracija NaCl.Disperzija AgNP u 50 v/v% DMEM pokazala je da je detektirana velika agregacija s povećanjem zeta potencijala i Z-prosječne vrijednosti te naglim smanjenjem intenziteta SPR-a.Vrijedno je napomenuti da je maksimalna veličina agregata izazvana DMEM-om nakon 24 sata obrnuto proporcionalna veličini nanočestica primera.
Interakcija između FBS i AgNP slična je onoj opaženoj u prisutnosti manjih molekula kao što su glukoza i glutamin, ali je učinak jači.Z prosjek čestica ostaje nepromijenjen, dok se detektira povećanje zeta potencijala.Vrh SPR-a pokazao je blagi crveni pomak, ali što je možda još zanimljivije, intenzitet SPR-a nije se tako značajno smanjio kao u kontrolnom mjerenju.Ovi se rezultati mogu objasniti urođenom adsorpcijom makromolekula na površini nanočestica (donji red na slici 4), što se danas shvaća kao stvaranje biomolekularne korone u tijelu.49