Nanočestice srebra (AgNP) smatraju se potencijalno korisnim alatom za kontrolu različitih patogena.Međutim, postoji zabrinutost oko otpuštanja AgNP-a u okolišne medije, budući da mogu izazvati štetne učinke na ljudsko zdravlje i okoliš.U ovoj smo studiji razvili i procijenili novi magnetski hibridni koloid (MHC) mikrometarske veličine ukrašen AgNP-ovima različitih veličina (AgNP-MHC).Nakon primjene za dezinfekciju, te se čestice mogu lako oporaviti iz okolišnog medija pomoću svojih magnetskih svojstava i ostaju učinkovite za deaktiviranje virusnih patogena.Procijenili smo učinkovitost AgNP-MHC za inaktivaciju bakteriofaga ϕX174, mišjeg norovirusa (MNV) i adenovirusa serotipa 2 (AdV2).Ovi ciljni virusi bili su izloženi AgNP-MHC-ima tijekom 1, 3 i 6 sati na 25°C, a zatim su analizirani testom plaka i TaqMan PCR-om u stvarnom vremenu.AgNP-MHC su bili izloženi širokom rasponu pH razina te vodi iz slavine i površinskoj vodi kako bi se procijenili njihovi antivirusni učinci u različitim uvjetima okoline.Među tri testirane vrste AgNP-MHC-a, Ag30-MHC-i su pokazali najveću učinkovitost za inaktivaciju virusa.ϕX174 i MNV smanjeni su za više od 2 log10 nakon izlaganja 4,6 × 109 Ag30-MHCs/ml tijekom 1 sata.Ovi rezultati pokazuju da se AgNP-MHC mogu koristiti za inaktivaciju virusnih patogena uz minimalnu mogućnost potencijalnog otpuštanja u okoliš.

S nedavnim napretkom u nanotehnologiji, nanočestice dobivaju sve veću pozornost diljem svijeta u područjima biotehnologije, medicine i javnog zdravstva (1,2).Zbog visokog omjera površine i volumena, materijali nano veličine, obično u rasponu od 10 do 500 nm, imaju jedinstvena fizikalno-kemijska svojstva u usporedbi s onima većih materijala (1).Oblik i veličina nanomaterijala mogu se kontrolirati, a specifične funkcionalne skupine mogu se konjugirati na njihovim površinama kako bi se omogućile interakcije s određenim proteinima ili unutarstanični unos (3,–5).

Nanočestice srebra (AgNP) naširoko su proučavane kao antimikrobni agens (6).Srebro se koristi u izradi finog pribora za jelo, za ukrašavanje i u terapeutskim sredstvima.Spojevi srebra kao što je srebrov sulfadiazin i određene soli korišteni su kao proizvodi za njegu rana i kao tretmani zaraznih bolesti zbog svojih antimikrobnih svojstava (6,7).Nedavne studije su otkrile da su AgNP vrlo učinkoviti za inaktivaciju raznih vrsta bakterija i virusa (8,–11).AgNP-ovi i Ag+ ioni oslobođeni iz AgNP-ova izravno komuniciraju s biomolekulama koje sadrže fosfor ili sumpor, uključujući DNA, RNA i proteine ​​(12,–14).Također se pokazalo da stvaraju reaktivne kisikove vrste (ROS), uzrokujući oštećenje membrane u mikroorganizmima (15).Veličina, oblik i koncentracija AgNP također su važni čimbenici koji utječu na njihove antimikrobne sposobnosti (8,10,13,16,17).

Prethodne studije također su istaknule nekoliko problema kada se AgNP koriste za kontrolu patogena u vodenom okruženju.Prvo, postojeće studije o učinkovitosti AgNP za inaktivaciju virusnih patogena u vodi su ograničene.Osim toga, monodisperzni AgNP obično su podložni agregaciji čestica-čestica zbog svoje male veličine i velike površine, a ti agregati smanjuju učinkovitost AgNP protiv mikrobnih patogena (7).Konačno, pokazalo se da AgNP imaju različite citotoksične učinke (5,18,–20), a otpuštanje AgNP-a u vodeni okoliš moglo bi rezultirati ljudskim zdravstvenim i ekološkim problemima.

Nedavno smo razvili novi magnetski hibridni koloid mikrometarske veličine (MHC) ukrašen AgNP-ovima različitih veličina (21,22).MHC jezgra se može koristiti za obnavljanje AgNP kompozita iz okoliša.Procijenili smo antivirusnu učinkovitost ovih nanočestica srebra na MHC (AgNP-MHC) pomoću bakteriofaga ϕX174, mišjeg norovirusa (MNV) i adenovirusa u različitim uvjetima okoliša.

Antivirusni učinci AgNP-MHCs u različitim koncentracijama protiv bakteriofaga ϕX174 (a), MNV (b) i AdV2 (c).Ciljani virusi tretirani su s različitim koncentracijama AgNP-MHCs, te s OH-MHCs (4,6 × 109 čestica/ml) kao kontrolom, u inkubatoru za mućkanje (150 okretaja u minuti, 1 h, 25°C).Metoda ispitivanja plaka korištena je za mjerenje preživjelih virusa.Vrijednosti su srednje vrijednosti ± standardne devijacije (SD) iz tri neovisna eksperimenta.Zvjezdice označavaju značajno različite vrijednosti (P< 0,05 jednosmjernom ANOVA s Dunnettovim testom).

Ova je studija pokazala da su AgNP-MHC učinkoviti za inaktivaciju bakteriofaga i MNV, surogata za ljudski norovirus, u vodi.Osim toga, AgNP-MHC se mogu lako obnoviti pomoću magneta, učinkovito sprječavajući otpuštanje potencijalno toksičnih AgNP u okoliš.Brojne prethodne studije pokazale su da su koncentracija i veličina čestica AgNP kritični čimbenici za inaktivaciju ciljanog mikroorganizma (8,16,17).Antimikrobni učinci AgNP također ovise o vrsti mikroorganizma.Učinkovitost AgNP-MHC za inaktivaciju ϕX174 pratila je odnos doza-odgovor.Među testiranim AgNP-MHC-ima, Ag30-MHC-i su imali veću učinkovitost za inaktivaciju ϕX174 i MNV.Za MNV, samo su Ag30-MHC pokazali antivirusno djelovanje, dok drugi AgNP-MHC nisu generirali nikakvu značajnu inaktivaciju MNV-a.Nijedan od AgNP-MHC nije imao značajnu antivirusnu aktivnost protiv AdV2.

Osim veličine čestica, koncentracija srebra u AgNP-MHC također je bila važna.Čini se da koncentracija srebra određuje učinkovitost antivirusnih učinaka AgNP-MHC.Koncentracije srebra u otopinama Ag07-MHCs i Ag30-MHCs pri 4,6 × 109 čestica/ml bile su 28,75 ppm odnosno 200 ppm i korelirale su s razinom antivirusne aktivnosti.Tablica 2sažima koncentracije srebra i površine testiranih AgNP-MHC.Ag07-MHC su pokazali najnižu antivirusnu aktivnost i imali su najnižu koncentraciju srebra i površinu, što sugerira da su ta svojstva povezana s antivirusnom aktivnošću AgNP-MHC.

Naša prethodna studija pokazala je da su glavni antimikrobni mehanizmi AgNP-MHCs kemijska apstrakcija Mg2+ ili Ca2+ iona iz mikrobnih membrana, stvaranje kompleksa s tiolnim skupinama smještenim na membranama i stvaranje reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) (21).Budući da AgNP-MHC imaju relativno veliku veličinu čestica (∼500 nm), malo je vjerojatno da mogu prodrijeti kroz virusnu kapsidu.Umjesto toga, čini se da AgNP-MHC stupaju u interakciju s površinskim proteinima virusa.AgNP na kompozitima imaju tendenciju vezati biomolekule koje sadrže tiolnu skupinu ugrađene u proteine ​​ovojnice virusa.Stoga su biokemijska svojstva virusnih kapsidnih proteina važna za određivanje njihove osjetljivosti na AgNP-MHC.Slika 1pokazuje različitu osjetljivost virusa na učinke AgNP-MHC.Bakteriofagi ϕX174 i MNV bili su osjetljivi na AgNP-MHC, ali je AdV2 bio otporan.Visoka razina otpornosti AdV2 vjerojatno je povezana s njegovom veličinom i strukturom.Adenovirusi su veličine od 70 do 100 nm (30), što ih čini mnogo većim od ϕX174 (27 do 33 nm) i MNV (28 do 35 nm) (31,32).Osim svoje velike veličine, adenovirusi imaju dvolančanu DNA, za razliku od drugih virusa, te su otporni na razne stresove iz okoliša kao što su toplina i UV zračenje (33,34).Naša prethodna studija je izvijestila da se gotovo 3-log10 smanjenje MS2 dogodilo s Ag30-MHC unutar 6 h (21).MS2 i ϕX174 imaju slične veličine s različitim vrstama nukleinskih kiselina (RNA ili DNA), ali imaju slične stope inaktivacije Ag30-MHC-ima.Stoga se čini da priroda nukleinske kiseline nije glavni čimbenik za otpornost na AgNP-MHC.Umjesto toga, čini se da su veličina i oblik virusne čestice važniji, jer je adenovirus puno veći virus.Ag30-MHC postigli su gotovo 2-log10 smanjenje M13 unutar 6 h (naši neobjavljeni podaci).M13 je jednolančani DNK virus (35) i duga je ~880 nm i promjera 6,6 nm (36).Stopa inaktivacije filamentoznog bakteriofaga M13 bila je posredna između onih malih virusa okrugle strukture (MNV, ϕX174 i MS2) i velikog virusa (AdV2).

U ovoj studiji, kinetika inaktivacije MNV bila je značajno različita u testu plaka i RT-PCR testu (Slika 2biic).c).Poznato je da molekularni testovi kao što je RT-PCR značajno podcjenjuju stope inaktivacije virusa (25,28), kao što je utvrđeno u našoj studiji.Budući da AgNP-MHC primarno komuniciraju s virusnom površinom, veća je vjerojatnost da će oštetiti proteine ​​virusne ovojnice nego virusne nukleinske kiseline.Stoga, RT-PCR test za mjerenje virusne nukleinske kiseline može značajno podcijeniti inaktivaciju virusa.Učinak Ag+ iona i stvaranje reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) trebali bi biti odgovorni za inaktivaciju testiranih virusa.Međutim, mnogi aspekti antivirusnih mehanizama AgNP-MHC-a još uvijek su nejasni, a potrebna su daljnja istraživanja korištenjem biotehnoloških pristupa kako bi se razjasnio mehanizam visoke otpornosti AdV2.

Konačno, procijenili smo robusnost antivirusnog djelovanja Ag30-MHC-a izlažući ih širokom rasponu pH vrijednosti i uzorcima vode iz slavine i površinske vode prije mjerenja njihove antivirusne aktivnosti (Slika 3ii4).4).Izloženost ekstremno niskim pH uvjetima rezultirala je fizičkim i/ili funkcionalnim gubitkom AgNP iz MHC (neobjavljeni podaci).U prisutnosti nespecifičnih čestica, Ag30-MHCs dosljedno pokazuju antivirusnu aktivnost, unatoč smanjenju antivirusne aktivnosti protiv MS2.Antivirusna aktivnost bila je najniža u nefiltriranoj površinskoj vodi, budući da je interakcija između Ag30-MHC i nespecifičnih čestica u jako zamućenoj površinskoj vodi vjerojatno uzrokovala smanjenje antivirusne aktivnosti (Tablica 3).Stoga bi u budućnosti trebalo provesti terenske procjene AgNP-MHC-a u različitim vrstama vode (npr. s različitim koncentracijama soli ili huminske kiseline).

Zaključno, novi Ag kompoziti, AgNP-MHC, imaju izvrsne antivirusne sposobnosti protiv nekoliko virusa, uključujući ϕX174 i MNV.AgNP-MHC zadržavaju snažnu učinkovitost u različitim uvjetima okoline, a te se čestice mogu lako oporaviti pomoću magneta, čime se smanjuju njihovi potencijalni štetni učinci na ljudsko zdravlje i okoliš.Ova je studija pokazala da kompozit AgNP može biti učinkovit antivirusni lijek u različitim okruženjima, bez značajnih ekoloških rizika.