A Javascript jelenleg le van tiltva a böngészőjében.Ha a javascript le van tiltva, a webhely egyes funkciói nem fognak működni.
Regisztrálja konkrét adatait és az érdeklődésre számot tartó gyógyszereket, mi pedig az Ön által megadott információkat a kiterjedt adatbázisunkban található cikkekkel párosítjuk, és egy PDF-másolatot e-mailben kellő időben elküldünk Önnek.
A kisebb nanorészecskék mindig jobbak?Ismerje meg az ezüst nanorészecskék méretfüggő aggregációjának biológiai hatásait biológiailag releváns körülmények között
Szerzők: Bélteky P, Rónavári A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Kónya Z
Bélteky Péter,1,* Rónavári Andrea,1,* Zakupszky Dalma,1 Boka Eszter,1 Igaz Nóra,2 Szerencsés Bettina,3 Pfeiffer Ilona,3 Vágvölgyi Csaba,3 Kiricsi Mónika Környezetkémia, Magyarország Természettudományi és Informatikai Kar , Szegedi Tudományegyetem;2 Szegedi Tudományegyetem Természettudományi és Információs Kar Biokémiai és Molekuláris Biológiai Tanszék;3 Szegedi Tudományegyetem Természettudományi és Információs Kar Mikrobiológiai Tanszék;4MTA-SZTE Reakciókinetikai és Felületkémiai Kutatócsoport, Szeged* Ezek a szerzők egyformán hozzájárultak ehhez a munkához.Kommunikáció: Kónya Zoltán Alkalmazott és Környezetkémia Tanszék, Szegedi Tudományegyetem Természettudományi és Informatikai Kar, Rerrich tér 1. Szeged, H-6720 Telefon +36 62 544620 E-mail [E-mail védelem] Cél: Az ezüst nanorészecskék (AgNP-k) az egyik leggyakrabban tanulmányozott nanoanyag, különösen orvosbiológiai alkalmazásaik miatt.A nanorészecskék aggregációja miatt azonban kiváló citotoxicitásuk és antibakteriális aktivitásuk gyakran sérül a biológiai közegben.Ebben a munkában három különböző, 10, 20 és 50 nm átlagos átmérőjű, citrátvégződésű ezüst nanorészecske minta aggregációs viselkedését és kapcsolódó biológiai aktivitásait vizsgáltuk.Módszer: Transzmissziós elektronmikroszkóp segítségével nanorészecskék szintetizálására és jellemzésére, dinamikus fényszórás és ultraibolya-látható spektroszkópia segítségével különböző pH-értékeken, NaCl-, glükóz- és glutaminkoncentrációknál értékeljük aggregációs viselkedésüket.Ezenkívül a sejttenyésztő tápközegben az olyan komponensek, mint a Dulbecco, javítják az aggregációs viselkedést az Eagle Mediumban és a Fetal Calf Serumban.Eredmények: Az eredmények azt mutatják, hogy a savas pH és a fiziológiás elektrolittartalom általában mikronméretű aggregációt indukál, amit biomolekuláris korona képződése közvetíthet.Érdemes megjegyezni, hogy a nagyobb részecskék nagyobb ellenállást mutatnak a külső hatásokkal szemben, mint kisebb társaik.In vitro citotoxicitási és antibakteriális vizsgálatokat végeztünk úgy, hogy a sejteket nanorészecske-aggregátumokkal kezeltük különböző aggregációs stádiumokban.Következtetés: Eredményeink mély összefüggést mutatnak ki a kolloid stabilitás és az AgNP-k toxicitása között, mivel az extrém aggregáció a biológiai aktivitás teljes elvesztéséhez vezet.A nagyobb részecskéknél megfigyelt magasabb fokú antiaggregáció jelentős hatással van az in vitro toxicitásra, mivel az ilyen minták több antimikrobiális és emlős sejtaktivitást őriznek meg.Ezek a megállapítások arra engednek következtetni, hogy a vonatkozó irodalom általános véleménye ellenére a lehető legkisebb nanorészecskék megcélzása nem feltétlenül a legjobb megoldás.Kulcsszavak: mag által közvetített növekedés, kolloid stabilitás, méretfüggő aggregációs viselkedés, aggregációs károsodás toxicitás
Ahogy a nanoanyagok iránti kereslet és kibocsátás folyamatosan növekszik, egyre nagyobb figyelmet fordítanak biológiai biztonságukra vagy biológiai aktivitásukra.Az ezüst nanorészecskék (AgNP) az egyik leggyakrabban szintetizált, kutatott és használt képviselői ennek az anyagosztálynak, kiváló katalitikus, optikai és biológiai tulajdonságaik miatt.1 Általános vélekedés, hogy a nanoanyagok (beleértve az AgNP-ket is) egyedi jellemzőit főként nagy fajlagos felületüknek tulajdonítják.Ezért elkerülhetetlenül probléma minden olyan folyamat, amely befolyásolja ezt a kulcsfontosságú jellemzőt, például a részecskeméretet, a felületi bevonatot vagy az aggregációt, függetlenül attól, hogy súlyosan károsítja-e a nanorészecskék tulajdonságait, amelyek kritikusak bizonyos alkalmazásokhoz.
A részecskeméret és a stabilizátorok hatásai viszonylag jól dokumentáltak a szakirodalomban.Például az általánosan elfogadott nézet az, hogy a kisebb nanorészecskék mérgezőbbek, mint a nagyobb nanorészecskék.2 Az általános szakirodalommal összhangban korábbi vizsgálataink kimutatták a nanoezüst méretfüggő aktivitását emlőssejteken és mikroorganizmusokon.3–5 A felületi bevonat egy másik olyan tulajdonság, amely széles körben befolyásolja a nanoanyagok tulajdonságait.Pusztán stabilizátorok hozzáadásával vagy módosításával a felületén ugyanaz a nanoanyag teljesen eltérő fizikai, kémiai és biológiai tulajdonságokkal rendelkezhet.A fedőanyagok alkalmazását leggyakrabban a nanorészecske szintézis részeként végzik.Például a citrát-végződésű ezüst nanorészecskék a kutatás egyik legrelevánsabb AgNP-jei, amelyek reakcióközegként kiválasztott stabilizáló oldatban ezüstsók redukálásával szintetizálódnak.6 A citrát könnyen kihasználhatja alacsony költségét, elérhetőségét, biokompatibilitását és erős affinitását az ezüsthöz, ami különböző javasolt kölcsönhatásokban tükröződhet, a reverzibilis felületi adszorpciótól az ionos kölcsönhatásokig.A 7,8 közelében kis molekulákat és többatomos ionokat, például citrátokat, polimereket, polielektrolitokat és biológiai anyagokat is gyakran használnak a nano-ezüst stabilizálására és egyedi funkcionalizálásra.9-12
Bár nagyon érdekes terület a nanorészecskék aktivitásának szándékos felületzárással történő megváltoztatása, ennek a felületi bevonatnak a fő szerepe elhanyagolható, kolloidális stabilitást biztosít a nanorészecske-rendszer számára.A nanoanyagok nagy fajlagos felülete nagy felületi energiát termel, ami gátolja a rendszer termodinamikai képességét, hogy elérje minimális energiáját.13 Megfelelő stabilizálás nélkül ez nanoanyagok agglomerációjához vezethet.Az aggregáció különböző alakú és méretű részecskék aggregátumainak képződése, amely akkor következik be, amikor a diszpergált részecskék találkoznak, és a jelenlegi termodinamikai kölcsönhatások lehetővé teszik a részecskék egymáshoz tapadását.Ezért stabilizátorokat használnak az aggregáció megakadályozására azáltal, hogy kellően nagy taszító erőt vezetnek be a részecskék közé, hogy ellensúlyozzák termodinamikai vonzásukat.14
Bár a részecskeméret és a felületi lefedettség témakörét alaposan feltárták a nanorészecskék által kiváltott biológiai aktivitások szabályozásával összefüggésben, a részecskeaggregáció nagyrészt elhanyagolt terület.Szinte nincs alapos tanulmány a nanorészecskék kolloid stabilitásának megoldására biológiailag releváns körülmények között.10,15-17 Ezen túlmenően ez a hozzájárulás különösen ritka, ahol az aggregációhoz kapcsolódó toxicitást is tanulmányozták, még akkor is, ha az mellékhatásokat, például vaszkuláris trombózist vagy a kívánt jellemzők elvesztését, például toxicitását, pl. ábrán látható 1.18, 19 látható.Valójában az ezüst nanorészecskékkel szembeni rezisztencia néhány ismert mechanizmusának egyike az aggregációhoz kapcsolódik, mivel egyes E. coli és Pseudomonas aeruginosa törzsek a flagellin, a flagellin fehérje expressziójával csökkentik nano-ezüst érzékenységüket.Nagy affinitása van az ezüsthöz, ezáltal aggregációt indukál.20
Számos különböző mechanizmus kapcsolódik az ezüst nanorészecskék toxicitásához, és az aggregáció hatással van ezekre a mechanizmusokra.Az AgNP biológiai aktivitásának legtöbbet tárgyalt módszere, amelyet néha „trójai faló” mechanizmusnak is neveznek, az AgNP-ket Ag+ hordozóknak tekinti.1,21 A trójai faló mechanizmus a lokális Ag+ koncentráció nagymértékű növekedését tudja biztosítani, ami ROS kialakulásához és membrándepolarizációhoz vezet.22-24 Az aggregáció befolyásolhatja az Ag+ felszabadulását, ezáltal befolyásolhatja a toxicitást, mert csökkenti a hatékony aktív felületet, ahol az ezüstionok oxidálódhatnak és feloldódhatnak.Az AgNP-k azonban nemcsak ionfelszabaduláson keresztül mutatnak toxicitást.Számos mérettel és morfológiával kapcsolatos kölcsönhatást kell figyelembe venni.Ezek közül a nanorészecske felületének mérete és alakja a meghatározó jellemzők.4,25 Ezeknek a mechanizmusoknak a gyűjteménye az „indukált toxicitási mechanizmusok” kategóriába sorolható.Potenciálisan sok mitokondriális és felszíni membránreakció létezik, amelyek károsíthatják az organellumokat és sejthalált okozhatnak.25-27 Mivel az aggregátumok kialakulása természetesen befolyásolja az élő rendszerek által felismert ezüsttartalmú objektumok méretét és alakját, ezek a kölcsönhatások is hatással lehetnek.
Az ezüst nanorészecskék aggregációjáról szóló korábbi cikkünkben egy hatékony szűrési eljárást mutattunk be, amely kémiai és in vitro biológiai kísérletekből áll a probléma tanulmányozására.19 A dinamikus fényszórás (DLS) az előnyben részesített technika az ilyen típusú vizsgálatokhoz, mivel az anyag a részecskéinek méretével összemérhető hullámhosszon képes szórni a fotonokat.Mivel a folyékony közegben a részecskék Brown-mozgási sebessége a mérettel függ össze, a szórt fény intenzitásának változása felhasználható a folyadékminta átlagos hidrodinamikai átmérőjének (Z-átlagának) meghatározására.28 Ezen túlmenően, a minta feszültségének alkalmazásával a nanorészecske zéta potenciálja (ζ potenciál) a Z átlagértékhez hasonlóan mérhető.13,28 Ha a zéta-potenciál abszolút értéke elég magas (az általános irányelvek szerint> ±30 mV), akkor erős elektrosztatikus taszítást generál a részecskék között, hogy ellensúlyozza az aggregációt.A karakterisztikus felületi plazmonrezonancia (SPR) egy egyedülálló optikai jelenség, amely elsősorban a nemesfém nanorészecskéknek (főleg Au és Ag) tulajdonítható.29​​ Ezen anyagok nanoméretű elektronoszcillációi (felületi plazmonjai) alapján ismert, hogy a gömb alakú AgNP-k jellegzetes UV-Vis abszorpciós csúcsa 400 nm közelében van.30 A részecskék intenzitása és hullámhossz-eltolódása a DLS eredmények kiegészítésére szolgál, mivel ezzel a módszerrel kimutatható a nanorészecskék aggregációja és a biomolekulák felületi adszorpciója.
A kapott információk alapján a sejtéletképességet (MTT) és az antibakteriális vizsgálatokat úgy végezzük, hogy az AgNP toxicitást az aggregációs szint függvényében írják le, nem pedig (a leggyakrabban használt faktor) nanorészecske-koncentrációt.Ez az egyedülálló módszer lehetővé teszi számunkra, hogy bemutassuk az aggregációs szint mélyreható jelentőségét a biológiai aktivitásban, mert például a citrát-terminált AgNP-k néhány órán belül teljesen elveszítik biológiai aktivitásukat az aggregáció következtében.19
Jelen munkánk során arra törekszünk, hogy nagymértékben kibővítsük korábbi hozzájárulásainkat a biológiai eredetű kolloidok stabilitásában és a biológiai aktivitásra gyakorolt ​​hatásában a nanorészecskeméret nanorészecske-aggregációra gyakorolt ​​hatásának vizsgálatával.Ez kétségtelenül a nanorészecskékkel kapcsolatos tanulmányok egyike.Magasabb perspektíva és 31 Ennek a kérdésnek a vizsgálatára mag-mediált növekedési módszert alkalmaztak citrátvégződésű AgNP-k előállítására három különböző mérettartományban (10, 20 és 50 nm).6,32, mint az egyik leggyakoribb módszer.Az orvosi alkalmazásokban széles körben és rutinszerűen használt nanoanyagokhoz különböző méretű citrátvégződésű AgNP-ket választanak ki, hogy tanulmányozzák a nanoezüst aggregációval kapcsolatos biológiai tulajdonságainak lehetséges méretfüggését.A különböző méretű AgNP-k szintetizálása után transzmissziós elektronmikroszkóppal (TEM) jellemeztük az előállított mintákat, majd a fent említett szűrési eljárással megvizsgáltuk a részecskéket.Ezenkívül in vitro sejtkultúrák, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) és Fetal Bovine Serum (FBS) jelenlétében értékelték a méretfüggő aggregációs viselkedést és viselkedését különböző pH-értékeken, NaCl-, glükóz- és glutaminkoncentrációkon.A citotoxicitás jellemzőit átfogó körülmények között határozzák meg.A tudományos konszenzus azt jelzi, hogy általában a kisebb részecskék előnyösebbek;vizsgálatunk kémiai és biológiai platformot biztosít annak meghatározására, hogy ez a helyzet.
Három különböző mérettartományú ezüst nanorészecskét állítottunk elő a Wan és munkatársai által javasolt mag-mediált növekedési módszerrel, kis módosításokkal.6 Ez a módszer kémiai redukción alapul, ezüstforrásként ezüst-nitrátot (AgNO3), redukálószerként nátrium-bórhidridet (NaBH4), stabilizátorként nátrium-citrátot használnak.Először készítsen 75 ml 9 mM citrát vizes oldatot nátrium-citrát-dihidrátból (Na3C6H5O7 x 2H2O), és melegítse 70 °C-ra.Ezután 2 ml 1 tömeg/térfogat%-os AgNO3 oldatot adtunk a reakcióelegyhez, majd a frissen készített nátrium-bór-hidrid oldatot (2 ml 0,1 tömeg/térfogat%-os) csepegtettük a keverékbe.A kapott sárgásbarna szuszpenziót erőteljes keverés közben 1 órán át 70 °C-on tartottuk, majd szobahőmérsékletre hűtöttük.A kapott mintát (a továbbiakban AgNP-I-nek nevezzük) a következő szintézislépésben a mag által közvetített növekedés alapjaként használják.
Közepes méretű részecskeszuszpenzió (AgNP-II-ként jelölve) szintetizálásához melegítsen fel 90 ml 7,6 mM citrát oldatot 80 °C-ra, keverje össze 10 ml AgNP-I-vel, majd keverjen össze 2 ml 1 tömeg/térfogat%-os AgNO3 oldatot. 1 órán át erőteljes mechanikus keverés alatt tartottuk, majd a mintát szobahőmérsékletre hűtöttük.
A legnagyobb részecske (AgNP-III) esetében ismételje meg ugyanazt a szaporítási folyamatot, de ebben az esetben 10 ml AgNP-II-t használjon magszuszpenzióként.Miután a minták elérik a szobahőmérsékletet, a teljes AgNO3-tartalom alapján a névleges Ag-koncentrációjukat 150 ppm-re állítják be további oldószer hozzáadásával vagy elpárologtatásával 40 °C-on, és végül 4 °C-on tárolják a további felhasználásig.
Használja a FEI Tecnai G2 20 X-Twin Transmission Electron Microscope (TEM) (FEI Corporate Headquarters, Hillsboro, Oregon, USA) 200 kV-os gyorsítófeszültséget a nanorészecskék morfológiai jellemzőinek vizsgálatához és elektrondiffrakciós (ED) mintázatának rögzítéséhez.Legalább 15 reprezentatív képet (körülbelül 750 részecske) értékeltünk ki az ImageJ szoftvercsomag segítségével, és az eredményül kapott hisztogramokat (és a teljes vizsgálatban szereplő összes grafikont) az OriginPro 2018-ban (OriginLab, Northampton, MA, USA) 33, 34 hoztuk létre.
Megmértük a minták átlagos hidrodinamikai átmérőjét (Z-átlag), zéta potenciálját (ζ-potenciál) és karakterisztikus felületi plazmonrezonanciáját (SPR), hogy szemléltesse a kezdeti kolloid tulajdonságaikat.A minta átlagos hidrodinamikai átmérőjét és zéta-potenciálját a Malvern Zetasizer Nano ZS műszerrel (Malvern Instruments, Malvern, UK) mértük, eldobható hajtogatott kapilláriscellák segítségével 37±0,1°C-on.Ocean Optics 355 DH-2000-BAL UV-Vis spektrofotométert (Halma PLC, Largo, FL, USA) használtunk a minták UV-Vis abszorpciós spektrumaiból a 250-800 nm tartományban jellemző SPR karakterisztikák meghatározására.
A teljes kísérlet során egyidejűleg három különböző mérési típust végeztünk a kolloid stabilitással kapcsolatban.Használja a DLS-t a részecskék átlagos hidrodinamikai átmérőjének (Z-átlag) és zéta-potenciáljának (ζ-potenciál) mérésére, mivel a Z-átlag a nanorészecske-aggregátumok átlagos méretéhez kapcsolódik, a zéta-potenciál pedig azt jelzi, hogy a rendszerben az elektrosztatikus taszítás elég erős ahhoz, hogy ellensúlyozza Van der Waals vonzerejét a nanorészecskék között.A méréseket háromszor végezzük, és a Z-átlag és a zéta-potenciál szórását a Zetasizer szoftver számítja ki.A részecskék jellegzetes SPR spektrumát UV-Vis spektroszkópiával értékeljük, mivel a csúcsintenzitás és a hullámhossz változása aggregációra és felületi kölcsönhatásokra utalhat.29,35 Valójában a nemesfémek felületi plazmonrezonanciája annyira befolyásos, hogy a biomolekulák új elemzési módszereihez vezetett.29,36,37 Az AgNP-k koncentrációja a kísérleti keverékben körülbelül 10 ppm, és a cél az, hogy a maximális kezdeti SPR-abszorpció intenzitását 1-re állítsuk. A kísérletet időfüggő módon, 0-n végeztük;1,5;3;6;12 és 24 óra különböző biológiailag releváns körülmények között.A kísérletet leíró további részletek korábbi munkánkban találhatók.19 Röviden, különböző pH-értékek (3; 5; 7,2 és 9), különböző nátrium-klorid (10 mM; 50 mM; 150 mM), glükóz (3,9 mM; 6,7 mM) és glutamin (4 mM) koncentrációk, ill. modellrendszerként elkészítette a Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) és Fetal Bovine Serum (FBS) (vízben és DMEM) szérumot is, és vizsgálta ezek hatását a szintetizált ezüst nanorészecskék aggregációs viselkedésére.pH A NaCl, a glükóz és a glutamin értékeit fiziológiás koncentrációk alapján értékeljük, míg a DMEM és FBS mennyisége megegyezik a teljes in vitro kísérletben használt szintekkel.38-42 Valamennyi mérést pH 7,2 és 37°C-on végeztük állandó 10 mM NaCl háttérsókoncentráció mellett, hogy kiküszöböljük a nagy távolságú részecskekölcsönhatásokat (kivéve bizonyos pH-val és NaCl-lel kapcsolatos kísérleteket, ahol ezek az attribútumok a változók tanulmány).28 A különböző állapotok listáját az 1. táblázat foglalja össze. A †-vel jelölt kísérlet referenciaként szolgál, és egy 10 mM NaCl-ot tartalmazó, 7,2 pH-értékű mintának felel meg.
A humán prosztatarák sejtvonalat (DU145) és az immortalizált humán keratinocitákat (HaCaT) az ATCC-től (Manassas, VA, USA) szereztük be.A sejteket rutinszerűen tenyésztjük Dulbecco Eagle (DMEM) minimális esszenciális tápközegében, amely 4,5 g/l glükózt tartalmaz (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), kiegészítve 10% FBS-sel, 2 mM L-glutaminnal, 0,01% sztreptomicinnel és 0,005% Penicillin (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA).A sejteket 37 °C-os inkubátorban tenyésztjük 5% CO2 és 95% páratartalom mellett.
A részecskeaggregáció okozta AgNP citotoxicitás változásának időfüggő feltárása érdekében kétlépéses MTT vizsgálatot végeztünk.Először a két sejttípus életképességét mérték AgNP-I, AgNP-II és AgNP-III kezelés után.Ebből a célból a kétféle sejtet 96 lyukú lemezekre oltottuk 10 000 sejt/lyuk sűrűséggel, és a második napon három különböző méretű ezüst nanorészecskékkel kezeltük növekvő koncentrációban.24 órás kezelés után a sejteket PBS-sel mostuk, és tenyésztőközegben hígított 0,5 mg/ml MTT-reagenssel (SERVA, Heidelberg, Németország) 1 órán át 37 °C-on inkubáltuk.A formazán kristályokat DMSO-ban (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) oldottuk, és az abszorpciót 570 nm-en Synergy HTX lemezleolvasóval (BioTek-Magyarország, Budapest, Magyarország) mértük.A kezeletlen kontroll minta abszorpciós értékét 100%-os túlélési aránynak tekintjük.Végezzen legalább 3 kísérletet négy független biológiai ismétlés használatával.Az IC50-et a vitalitási eredmények alapján a dózis-válasz görbéből számítják ki.
Ezt követően, a második lépésben a részecskéket 150 mM NaCl-al inkubálva különböző ideig (0, 1,5, 3, 6, 12 és 24 óra) a sejtkezelés előtt, különböző aggregációs állapotú ezüst nanorészecskéket állítottunk elő.Ezt követően ugyanazt az MTT vizsgálatot hajtottuk végre, mint korábban leírtuk, hogy értékeljük a sejtek életképességében a részecske-aggregáció által befolyásolt változásokat.A GraphPad Prism 7 segítségével értékelje ki a végeredményt, számítsa ki a kísérlet statisztikai szignifikanciáját páratlan t-próbával, és jelölje meg a szintjét * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01), *** (p ≤ 0,001) ) És **** (p ≤ 0,0001).
Három különböző méretű ezüst nanorészecskét (AgNP-I, AgNP-II és AgNP-III) használtak a Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM; Patogén Gombák és Mikrobatoxikológiai Kutatóközpont, Chiba Egyetem) és Bacillus Test megatérium 6031SZMC megatérium antibakteriális érzékenységére. (SZMC: Szegedi Mikrobiológiai Gyűjtemény) és E. coli SZMC 0582 RPMI 1640 táptalajban (Sigma-Aldrich Co.).A részecskék aggregációja által az antibakteriális aktivitásban bekövetkezett változások értékeléséhez először 96 lyukú mikrotiter lemezen mikrohígítással meghatároztuk azok minimális gátló koncentrációját (MIC).50 μl standardizált sejtszuszpenzióhoz (5 × 104 sejt/ml RPMI 1640 tápközegben) adjunk 50 µl ezüst nanorészecske szuszpenziót, és sorozathígítsuk a koncentráció kétszeresét (a fent említett tápközegben a tartomány 0 és 75 ppm, azaz a kontroll minta 50 μL sejtszuszpenziót és 50 μL nanorészecskék nélküli táptalajt tartalmaz).Ezt követően a lemezt 30 °C-on 48 órán át inkubáltuk, és a tenyészet optikai sűrűségét 620 nm-en mértük SPECTROstar Nano lemezleolvasóval (BMG LabTech, Offenburg, Németország).A kísérletet háromszor végeztük el három párhuzamosban.
Eltekintve attól, hogy ekkor 50 μl egyedi aggregált nanorészecske mintát használtak, a korábban leírt eljárást alkalmaztuk az aggregáció antibakteriális aktivitásra gyakorolt ​​hatásának vizsgálatára a fent említett törzseken.Az ezüst nanorészecskék különböző aggregációs állapotait állítják elő, ha a részecskéket 150 mM NaCl-dal inkubálják különböző ideig (0, 1,5, 3, 6, 12 és 24 óráig) a sejtfeldolgozás előtt.Növekedési kontrollként 50 μl RPMI 1640 táptalajjal kiegészített szuszpenziót, míg a toxicitás szabályozására nem aggregált nanorészecskéket tartalmazó szuszpenziót használtunk.A kísérletet háromszor végeztük el három párhuzamosban.Használja a GraphPad Prism 7-et a végeredmény újbóli kiértékeléséhez, ugyanazt a statisztikai elemzést használva, mint az MTT-elemzésnél.
A legkisebb részecskék (AgNP-I) aggregációs szintjét jellemeztük, és az eredményeket részben publikáltuk korábbi munkánkban, de a jobb összehasonlítás érdekében minden részecskét alaposan átvizsgáltunk.A kísérleti adatokat összegyűjtjük és a következő szakaszokban tárgyaljuk.Három méretű AgNP.19
A TEM, UV-Vis és DLS által végzett mérések igazolták az összes AgNP minta sikeres szintézisét (2A-D ábra).A 2. ábra első sora szerint a legkisebb részecske (AgNP-I) egyenletes gömb alakú morfológiát mutat, átlagosan körülbelül 10 nm átmérővel.A mag által közvetített növekedési módszer különböző mérettartományú AgNP-II-t és AgNP-III-t is biztosít, amelyek átlagos részecskeátmérője körülbelül 20 nm, illetve 50 nm.A szemcseeloszlás szórása szerint a három minta mérete nem fedi egymást, ami az összehasonlító elemzésük szempontjából fontos.A TEM alapú részecske 2D vetületek átlagos méretarányának és vékonyságarányának összehasonlításával feltételezzük, hogy a részecskék gömbölyűségét az ImageJ alakszűrő beépülő modulja értékeli (2E. ábra).43 A részecskék alakjának elemzése szerint méretarányukat (a legkisebb határoló téglalap nagy oldala/rövid oldala) nem befolyásolja a részecskenövekedés, vékonyságuk arányát (a megfelelő tökéletes kör mért területe/elméleti területe) ) fokozatosan csökken.Ennek eredményeként egyre több poliéderes részecske keletkezik, amelyek elméletileg tökéletesen kerekek, és 1-es vékonysági aránynak felelnek meg.
2. ábra Transzmissziós elektronmikroszkóp (TEM) képe (A), elektrondiffrakciós (ED) mintázat (B), méreteloszlási hisztogram (C), jellegzetes ultraibolya-látható (UV-Vis) fényelnyelési spektrum (D) és átlagos folyadék-citrát -végződésű ezüst nanorészecskék mechanikai átmérőjű (Z-átlag), zéta potenciállal, méretaránnyal és vastagságaránnyal (E) három különböző mérettartománnyal rendelkeznek: AgNP-I 10 nm (felső sor), AgNP -II 20 nm (középső sor). ), az AgNP-III (alsó sor) 50 nm.
Bár a növekedési módszer ciklikussága bizonyos mértékben befolyásolta a részecske alakját, ami a nagyobb AgNP-k kisebb gömbölyűségét eredményezte, mindhárom minta kvázi gömb alakú maradt.Ezen túlmenően, amint az a 2B. ábrán látható elektrondiffrakciós mintán látható, nano A részecskék kristályosságát ez nem befolyásolja.A kiemelkedő diffrakciós gyűrű – amely korrelálható az ezüst (111), (220), (200) és (311) Miller indexével – nagyon összhangban van a tudományos irodalommal és korábbi hozzájárulásainkkal.9, 19,44 Az AgNP-II és az AgNP-III Debye-Scherrer gyűrűjének töredezettsége annak tudható be, hogy az ED-képet azonos nagyítással rögzítik, így a részecskeméret növekedésével a diffrakciós részecskék száma per egységnyi terület növekszik és csökken .
Ismeretes, hogy a nanorészecskék mérete és alakja befolyásolja a biológiai aktivitást.3,45 Az alakfüggő katalitikus és biológiai aktivitás azzal magyarázható, hogy a különböző formák hajlamosak bizonyos kristálylapok burjánzására (különböző Miller indexekkel), és ezek a kristálylapok eltérő aktivitásúak.45,46 Mivel az elkészített részecskék hasonló, nagyon hasonló kristályjellemzőknek megfelelő ED eredményeket adnak, feltételezhető, hogy a későbbi kolloid stabilitási és biológiai aktivitási kísérleteink során az esetleges eltéréseket a nanorészecske méretének, nem pedig az alakhoz kapcsolódó tulajdonságoknak kell tulajdonítani.
A 2D ábrán összefoglalt UV-Vis eredmények tovább hangsúlyozzák a szintetizált AgNP túlnyomó gömbszerűségét, mivel mindhárom minta SPR csúcsai 400 nm körüliek, ami a gömb alakú ezüst nanorészecskék jellemző értéke.29,30 A felvett spektrumok is megerősítették a nanoezüst sikeres mag által közvetített növekedését.A részecskeméret növekedésével az AgNP-II maximális fényelnyelésének megfelelő hullámhossz-kiemelkedőbb- Az irodalom szerint az AgNP-III vöröseltolódást tapasztalt.6,29
Az AgNP rendszer kezdeti kolloid stabilitását illetően DLS-t használtunk a részecskék átlagos hidrodinamikai átmérőjének és zéta potenciáljának mérésére pH 7,2-nél.A 2E ábrán látható eredmények azt mutatják, hogy az AgNP-III magasabb kolloid stabilitású, mint az AgNP-I vagy az AgNP-II, mivel az általános irányelvek azt mutatják, hogy a hosszú távú kolloid stabilitáshoz 30 mV abszolút zéta-potenciál szükséges. a Z átlagértéket (amelyet a szabad és aggregált részecskék átlagos hidrodinamikai átmérőjeként kapunk) összehasonlítjuk a TEM által kapott elsődleges részecskemérettel, mert minél közelebb van a két érték, annál enyhébb a Gyűjtés mértéke a mintában.Valójában az AgNP-I és az AgNP-II Z-átlaga jóval magasabb, mint a fő TEM által kiértékelt részecskeméretük, így az AgNP-III-hoz képest ezek a minták várhatóan nagyobb valószínűséggel aggregálódnak, ahol az erősen negatív zéta potenciál. közeli méret kíséri A Z átlagérték.
A jelenség magyarázata kettős lehet.Egyrészt a citrátkoncentrációt minden szintézislépésben hasonló szinten tartják, viszonylag nagy mennyiségű töltött felületi csoportot biztosítva, hogy megakadályozzák a növekvő részecskék fajlagos felületének csökkenését.Levak és munkatársai szerint azonban az olyan kis molekulák, mint a citrát, könnyen kicserélhetők a nanorészecskék felületén lévő biomolekulákkal.Ebben az esetben a kolloid stabilitást az előállított biomolekulák koronája határozza meg.31 Mivel ez a viselkedés aggregációs méréseink során is megfigyelhető volt (a későbbiekben részletesebben lesz szó), a citrátsapka önmagában nem magyarázhatja ezt a jelenséget.
Másrészt a részecskeméret fordítottan arányos a nanométer szintű aggregációs tendenciával.Ezt főként a hagyományos Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO) módszer támasztja alá, ahol a részecskék vonzását a részecskék közötti vonzó és taszító erők összegeként írják le.He és munkatársai szerint a DLVO energiagörbe maximális értéke a hematit nanorészecskékben lévő nanorészecskék méretével csökken, így könnyebben elérhető a minimális primer energia, ezáltal elősegíti az irreverzibilis aggregációt (kondenzációt).47 A feltételezések szerint azonban a DLVO elmélet korlátain túl vannak más szempontok is.Bár a van der Waals gravitáció és az elektrosztatikus kétrétegű taszítás hasonló a részecskeméret növekedésével, Hotze et al.azt javasolja, hogy erősebb hatással legyen az aggregációra, mint amit a DLVO lehetővé tesz.14 Úgy vélik, hogy a nanorészecskék felületi görbülete már nem becsülhető sík felületként, így a matematikai becslés nem alkalmazható.Ezen túlmenően, ahogy a részecskeméret csökken, a felületen jelenlévő atomok százalékos aránya megnő, ami elektronszerkezethez és felületi töltési viselkedéshez vezet.És a felületi reaktivitás megváltozik, ami az elektromos kettős réteg töltésének csökkenéséhez vezethet, és elősegíti az aggregációt.
Az AgNP-I, AgNP-II és AgNP-III DLS-eredményeinek összehasonlításakor a 3. ábrán azt tapasztaltuk, hogy mindhárom minta hasonló pH-érték aggregációt mutatott.Az erősen savas környezet (pH 3) a minta zéta-potenciálját 0 mV-ra tolja el, aminek következtében a részecskék mikron méretű aggregátumokat képeznek, míg a lúgos pH a zéta-potenciálját egy nagyobb negatív értékre tolja el, ahol a részecskék kisebb aggregátumokat képeznek (pH 5). ).és 7,2) ), vagy teljesen aggregálatlan marad (pH 9).Néhány lényeges különbséget is megfigyeltek a különböző minták között.A kísérlet során az AgNP-I bizonyult a legérzékenyebbnek a pH-indukált zéta-potenciálváltozásokra, mivel ezeknek a részecskéknek a zéta-potenciálja pH 7,2-nél lecsökkent pH 9-hez képest, míg az AgNP-II és az AgNP-III csak A-t mutatott. A ζ jelentős változása pH 3 körül van. Ezenkívül az AgNP-II lassabb változásokat és mérsékelt zéta potenciált mutatott, míg az AgNP-III a legenyhébb viselkedést mutatta a három közül, mivel a rendszer a legmagasabb abszolút zéta értéket és lassú trendmozgást mutatott. AgNP-III A leginkább ellenálló a pH által kiváltott aggregációval szemben.Ezek az eredmények összhangban vannak az átlagos hidrodinamikai átmérő mérési eredményekkel.A primerek szemcseméretét figyelembe véve az AgNP-I minden pH-értéknél állandó fokozatos aggregációt mutatott, nagy valószínűséggel a 10 mM NaCl háttérnek köszönhetően, míg az AgNP-II és az AgNP-III csak 3-as pH értéknél mutatott szignifikáns aggregációt.A legérdekesebb különbség az, hogy nagy nanorészecskemérete ellenére az AgNP-III pH 3-on 24 óra alatt képezi a legkisebb aggregátumokat, kiemelve aggregációgátló tulajdonságait.A 24 óra elteltével pH 3-as AgNP-k átlagos Z-értékét elosztva az előkészített minta értékével, megfigyelhető, hogy az AgNP-I és az AgNP-II relatív aggregátumméretei 50-szeresére, 42-szeresére és 22-szeresére nőttek. , ill.III.
3. ábra A növekvő méretű citrátvégződésű ezüst nanorészecskék (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II és 50 nm: AgNP-III) dinamikus fényszórási eredményeit az átlagos hidrodinamikai átmérővel (Z átlag) fejezzük ki. ) (jobbra) Különböző pH-viszonyok között a zéta-potenciál (balra) 24 órán belül megváltozik.
A megfigyelt pH-függő aggregáció az AgNP minták jellegzetes felszíni plazmonrezonanciáját (SPR) is befolyásolta, amint azt UV-Vis spektrumaik igazolják.Az S1 kiegészítő ábra szerint mindhárom ezüst nanorészecske szuszpenzió aggregációját az SPR csúcsok intenzitásának csökkenése és mérsékelt vöröseltolódás követi.Ezen változások mértéke a pH függvényében összhangban van a DLS eredmények által előre jelzett aggregáció mértékével, azonban néhány érdekes tendencia is megfigyelhető.A megérzésekkel ellentétben kiderült, hogy a közepes méretű AgNP-II a legérzékenyebb az SPR változásokra, míg a másik két minta kevésbé érzékeny.Az SPR-kutatásban az 50 nm az elméleti részecskeméret-határ, amelyet a részecskék dielektromos tulajdonságaik alapján történő megkülönböztetésére használnak.Az 50 nm-nél kisebb részecskék (AgNP-I és AgNP-II) egyszerű dielektromos dipólusokként írhatók le, míg az ezt a határt elérő vagy meghaladó részecskék (AgNP-III) bonyolultabb dielektromos tulajdonságokkal és rezonanciájukkal A sáv multimodális változásokra szakad. .Két kisebb részecskeminta esetén az AgNP-k egyszerű dipólusnak tekinthetők, és a plazma könnyen átfedheti egymást.A részecskeméret növekedésével ez a kapcsolás lényegében nagyobb plazmát eredményez, ami magyarázatot adhat a nagyobb megfigyelt érzékenységre.29 A legnagyobb részecskék esetében azonban az egyszerű dipólusbecslés nem érvényes, ha más csatolási állapotok is előfordulhatnak, ami megmagyarázhatja az AgNP-III spektrális változásra utaló hajlamának csökkenését.29
Kísérleti körülményeink között bebizonyosodott, hogy a pH-érték nagymértékben befolyásolja a különböző méretű, citráttal bevont ezüst nanorészecskék kolloid stabilitását.Ezekben a rendszerekben a stabilitást az AgNP-k felületén található negatív töltésű -COO- csoportok biztosítják.A citrátion karboxilát funkciós csoportja nagyszámú H+ ionban protonálódik, így a keletkezett karboxilcsoport már nem tud elektrosztatikus taszítást biztosítani a részecskék között, ahogy az a 4. ábra felső sorában is látható. Le Chatelier elve szerint az AgNP a minták pH 3-on gyorsan aggregálódnak, de a pH növekedésével fokozatosan egyre stabilabbá válnak.
4. ábra A felületi kölcsönhatás sematikus mechanizmusa, amelyet különböző pH-érték (felső sor), NaCl-koncentráció (középső sor) és biomolekulák (alsó sor) melletti aggregáció határoz meg.
Az 5. ábra szerint a különböző méretű AgNP szuszpenziókban a kolloid stabilitást is vizsgáltuk növekvő sókoncentráció mellett.A zéta-potenciál alapján a megnövekedett nanorészecskeméret ezekben a citrát-végződésű AgNP-rendszerekben ismét fokozott ellenállást biztosít a NaCl külső hatásaival szemben.Az AgNP-I-ben 10 mM NaCl elegendő az enyhe aggregáció indukálásához, és az 50 mM sókoncentráció nagyon hasonló eredményeket ad.Az AgNP-II-ben és AgNP-III-ban a 10 mM NaCl nem befolyásolja szignifikánsan a zéta-potenciált, mert értékeik (AgNP-II) -30 mV alatt maradnak (AgNP-III).A NaCl koncentráció 50 mM-ra, végül 150 mM NaCl-ra növelése elegendő ahhoz, hogy minden mintában jelentősen csökkenjen a zéta potenciál abszolút értéke, bár a nagyobb részecskék több negatív töltést őriznek meg.Ezek az eredmények összhangban vannak az AgNP-k várható átlagos hidrodinamikai átmérőjével;a 10, 50 és 150 mM NaCl-on mért Z átlag trendvonalak eltérő, fokozatosan növekvő értékeket mutatnak.Végül mindhárom 150 mM-es kísérletben mikron méretű aggregátumokat detektáltunk.
5. ábra A növekvő méretű citrátvégződésű ezüst nanorészecskék (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II és 50 nm: AgNP-III) dinamikus fényszórási eredményeit az átlagos hidrodinamikai átmérővel (Z átlag) fejezzük ki. ) (jobbra) és zéta potenciál (balra) 24 órán belül megváltozik különböző NaCl koncentrációk mellett.
Az UV-Vis eredmények az S2 kiegészítő ábrán azt mutatják, hogy az 50 és 150 mM NaCl SPR mindhárom mintában azonnali és jelentős csökkenést mutat.Ez a DLS-sel magyarázható, mivel a NaCl alapú aggregáció gyorsabban megy végbe, mint a pH-függő kísérletek, ami a korai (0, 1,5 és 3 órás) mérések közötti nagy különbséggel magyarázható.Emellett a sókoncentráció növelése a kísérleti közeg relatív permittivitását is növeli, ami mélyreható hatással lesz a felületi plazmonrezonanciára.29
A NaCl hatását a 4. ábra középső sora foglalja össze. Általánosságban megállapítható, hogy a nátrium-klorid koncentrációjának növelése hasonló hatást fejt ki, mint a savasság növelése, mivel a Na+ ionok hajlamosak a karboxilátcsoportok körüli koordinációra. a negatív zéta potenciális AgNP-k elnyomása.Emellett 150 mM NaCl mikron méretű aggregátumokat termelt mindhárom mintában, ami azt jelzi, hogy a fiziológiás elektrolitkoncentráció káros a citrátvégződésű AgNP-k kolloid stabilitására nézve.Ha figyelembe vesszük a NaCl kritikus kondenzációs koncentrációját (CCC) hasonló AgNP rendszereken, ezek az eredmények ügyesen elhelyezhetők a vonatkozó irodalomban.Huynh et al.kiszámította, hogy a NaCl CCC citrátvégződésű ezüst nanorészecskék esetében, amelyek átlagos átmérője 71 nm, 47,6 mM volt, míg El Badawy et al.megfigyelték, hogy a citrát bevonatú 10 nm-es AgNP-k CCC-je 70 mM volt.10,16 Ezen kívül a szignifikánsan magas, körülbelül 300 mM CCC-t mérték He és munkatársai, ami miatt a szintézis módszere eltér a korábban említett publikációtól.48 Bár a mostani hozzájárulás nem ezen értékek átfogó elemzésére irányul, mivel kísérleti körülményeink a teljes vizsgálat összetettségében egyre nőnek, a biológiailag releváns 50 mM NaCl koncentráció, különösen a 150 mM NaCl, meglehetősen magasnak tűnik.Indukált koaguláció, ami megmagyarázza az észlelt erős változásokat.
A polimerizációs kísérlet következő lépése az egyszerű, de biológiailag releváns molekulák alkalmazása a nanorészecske-biomolekula kölcsönhatások szimulálására.A DLS (6. és 7. ábra) és az UV-Vis eredmények (S3 és S4 kiegészítő ábra) alapján néhány általános következtetés vonható le.Kísérleti körülményeink között a vizsgált glükóz és glutamin molekulák egyik AgNP rendszerben sem indukálnak aggregációt, mivel a Z-átlag trend szorosan összefügg a megfelelő referencia mérési értékkel.Bár jelenlétük nem befolyásolja az aggregációt, a kísérleti eredmények azt mutatják, hogy ezek a molekulák részben adszorbeálódnak az AgNP-k felületén.Ezt a nézetet alátámasztó legszembetűnőbb eredmény a fényelnyelés megfigyelt változása.Bár az AgNP-I nem mutat jelentős hullámhossz- vagy intenzitásváltozást, nagyobb részecskék mérésével tisztábban megfigyelhető, ami valószínűleg a korábban említett nagyobb optikai érzékenységnek köszönhető.A glükóz koncentrációtól függetlenül 1,5 óra elteltével nagyobb vöröseltolódást okozhat, mint a kontroll mérésnél, ami AgNP-II-ben kb. 40 nm, AgNP-III-ban kb. 10nm, ami a felületi kölcsönhatások előfordulását bizonyítja.A glutamin hasonló tendenciát mutatott, de a változás nem volt annyira szembetűnő.Emellett érdemes megemlíteni, hogy a glutamin csökkentheti a közepes és nagy részecskék abszolút zéta potenciálját.Mivel azonban úgy tűnik, hogy ezek a zéta-változások nem befolyásolják az aggregációs szintet, feltételezhető, hogy még az olyan kis biomolekulák is, mint a glutamin, képesek bizonyos fokú térbeli taszítást biztosítani a részecskék között.
6. ábra A növekvő méretű citrátvégződésű ezüst nanorészecske minták dinamikus fényszórási eredményeit (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II és 50 nm: AgNP-III) az átlagos hidrodinamikai átmérővel (Z átlag) fejezzük ki. (jobbra) Különböző glükózkoncentrációjú külső körülmények között a zéta-potenciál (balra) 24 órán belül megváltozik.
7. ábra A növekvő méretű citrátvégződésű ezüst nanorészecskék (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II és 50 nm: AgNP-III) dinamikus fényszórási eredményeit az átlagos hidrodinamikai átmérővel (Z átlag) fejezzük ki. ) (jobbra) Glutamin jelenlétében a zéta potenciál (balra) 24 órán belül megváltozik.
Röviden, a kis biomolekulák, mint a glükóz és a glutamin, nem befolyásolják a kolloid stabilitást a mért koncentráció mellett: bár különböző mértékben befolyásolják a zéta-potenciált és az UV-Vis eredményeket, a Z átlageredmények nem konzisztensek.Ez azt jelzi, hogy a molekulák felületi adszorpciója gátolja az elektrosztatikus taszítást, ugyanakkor méretstabilitást biztosít.
A korábbi eredmények és a korábbi eredmények összekapcsolása és a biológiai viszonyok ügyesebb szimulációja érdekében kiválasztottuk a leggyakrabban használt sejtkultúra komponenseket, és ezeket kísérleti feltételekként használtuk az AgNP kolloidok stabilitásának vizsgálatához.A teljes in vitro kísérletben a DMEM mint közeg egyik legfontosabb funkciója a szükséges ozmotikus körülmények megteremtése, de kémiai szempontból egy komplex sóoldat, amelynek összionerőssége a 150 mM NaCl-hoz hasonló. .40 Ami az FBS-t illeti, a felszíni adszorpció szempontjából biomolekulák – főként fehérjék – összetett keveréke, kémiai összetétele és diverzitása ellenére is van némi hasonlósága a glükóz és glutamin kísérleti eredményeivel. Az ivar sokkal bonyolultabb.19 DLS és UV-A 8. ábrán, illetve az S5 kiegészítő ábrán látható látható eredmények magyarázhatók ezen anyagok kémiai összetételének vizsgálatával és az előző részben végzett mérésekkel való korrelációval.
8. ábra A növekvő méretű citrátvégződésű ezüst nanorészecskék (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II és 50 nm: AgNP-III) dinamikus fényszórási eredményeit az átlagos hidrodinamikai átmérővel (Z átlag) fejezzük ki. ) (jobbra) Sejtkultúra DMEM és FBS komponensek jelenlétében a zéta potenciál (balra) 24 órán belül megváltozik.
A különböző méretű AgNP-k hígítása DMEM-ben hasonló hatással van a kolloid stabilitásra, mint a magas NaCl-koncentráció esetén.Az AgNP diszperziója 50 v/v%-os DMEM-ben azt mutatta, hogy nagy léptékű aggregációt észleltünk a zéta potenciál és a Z-átlag érték növekedésével, valamint az SPR intenzitás meredek csökkenésével.Érdemes megjegyezni, hogy a DMEM által 24 óra elteltével indukált maximális aggregátumméret fordítottan arányos a primer nanorészecskék méretével.
Az FBS és az AgNP közötti kölcsönhatás hasonló a kisebb molekulák, például glükóz és glutamin jelenlétében megfigyelthez, de a hatás erősebb.A részecskék Z-átlaga változatlan marad, miközben a zéta-potenciál növekedése észlelhető.Az SPR csúcs enyhe vöröseltolódást mutatott, de ami talán még érdekesebb, az SPR intenzitása nem csökkent olyan jelentős mértékben, mint a kontroll mérésnél.Ezek az eredmények a makromolekulák veleszületett adszorpciójával magyarázhatók a nanorészecskék felületén (a 4. ábra alsó sora), amely ma már biomolekuláris korona kialakulását jelenti a szervezetben.49