Az ezüst nanorészecskéket (AgNP-ket) potenciálisan hasznos eszköznek tekintik különféle kórokozók leküzdésében.Mindazonáltal aggodalomra ad okot az AgNP-k környezeti közegbe való kibocsátása, mivel káros emberi egészségre és ökológiai hatásokat okozhatnak.Ebben a tanulmányban egy új, mikrométer méretű mágneses hibrid kolloidot (MHC) fejlesztettünk ki és értékeltünk, amelyet különböző méretű AgNP-kkel (AgNP-MHC) díszítettek.Fertőtlenítés után ezek a részecskék mágneses tulajdonságaik segítségével könnyen kinyerhetők a környezeti közegből, és hatékonyak maradnak a vírusos kórokozók inaktiválására.Értékeltük az AgNP-MHC-k hatékonyságát a ϕX174 bakteriofág, az egér norovírus (MNV) és a 2-es szerotípusú adenovírus (AdV2) inaktiválására.Ezeket a célvírusokat 1, 3 és 6 órán át 25 °C-on AgNP-MHC-nek tettük ki, majd plakk-vizsgálattal és valós idejű TaqMan PCR-rel elemeztük.Az AgNP-MHC-ket sokféle pH-értéknek, csapvíznek és felszíni víznek tették ki, hogy különböző környezeti feltételek mellett értékeljék vírusellenes hatásukat.A három vizsgált AgNP-MHC közül az Ag30-MHC mutatta a legnagyobb hatékonyságot a vírusok inaktiválására.A ϕX174 és az MNV több mint 2 log10-kal csökkent 4,6 × 109 Ag30-MHC/ml 1 órás expozíció után.Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az AgNP-MHC-k felhasználhatók vírusos kórokozók inaktiválására, minimális eséllyel a környezetbe való kijutással.

A nanotechnológia közelmúltbeli fejlődésével a nanorészecskék világszerte fokozott figyelmet kapnak a biotechnológia, az orvostudomány és a közegészségügy területén.1,2).Magas felület/térfogat arányuk miatt a nanoméretű, jellemzően 10-500 nm-es anyagok a nagyobb anyagokhoz képest egyedülálló fizikai-kémiai tulajdonságokkal rendelkeznek.1).A nanoanyagok alakja és mérete szabályozható, felületükön specifikus funkciós csoportok konjugálhatók, hogy lehetővé váljon bizonyos fehérjékkel való kölcsönhatás vagy intracelluláris felvétel (3,–5).

Az ezüst nanorészecskéket (AgNP-ket) széles körben tanulmányozták antimikrobiális szerként.6).Az ezüstöt finom evőeszközök készítésére, díszítésre és terápiás szerként használják.Az ezüstvegyületeket, például az ezüst-szulfadiazint és bizonyos sókat antimikrobiális tulajdonságaik miatt sebápoló szerként és fertőző betegségek kezelésére használták.6,7).A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy az AgNP-k nagyon hatékonyak különféle baktériumok és vírusok inaktiválására.8,–11).Az AgNP-kből felszabaduló AgNP-k és Ag+-ionok közvetlenül kölcsönhatásba lépnek foszfor- vagy kéntartalmú biomolekulákkal, beleértve a DNS-t, az RNS-t és a fehérjéket.12,–14).Azt is kimutatták, hogy reaktív oxigénfajtákat (ROS) hoznak létre, ami a mikroorganizmusok membránkárosodását okozza.15).Az AgNP-k mérete, alakja és koncentrációja szintén fontos tényezők, amelyek befolyásolják antimikrobiális képességeiket.8,10,13,16,17).

A korábbi tanulmányok több problémára is rávilágítottak, amikor az AgNP-ket vízi környezetben lévő kórokozók leküzdésére használják.Először is, az AgNP-k hatékonyságáról a vírusos kórokozók vízben történő inaktiválására vonatkozó jelenlegi tanulmányok korlátozottak.Ezenkívül a monodiszperz AgNP-k jellemzően részecske-részecske aggregációnak vannak kitéve kis méretük és nagy felületük miatt, és ezek az aggregátumok csökkentik az AgNP-k hatékonyságát a mikrobiális kórokozókkal szemben.7).Végül az AgNP-kről kimutatták, hogy különböző citotoxikus hatásokkal rendelkeznek (5,18,–20), és az AgNP-k vízi környezetbe jutása emberi egészségügyi és ökológiai problémákat okozhat.

Nemrég kifejlesztettünk egy új, mikrométer méretű mágneses hibrid kolloidot (MHC), amelyet különböző méretű AgNP-kkel díszítettek (21,22).Az MHC mag felhasználható az AgNP kompozitok visszanyerésére a környezetből.Értékeltük ezen ezüst nanorészecskék antivirális hatékonyságát MHC-ken (AgNP-MHC) ϕX174 bakteriofág, rágcsáló norovírus (MNV) és adenovírus segítségével különböző környezeti feltételek mellett.

Az AgNP-MHC-k vírusellenes hatásai különböző koncentrációkban a ϕX174 (a), MNV (b) és AdV2 (c) bakteriofág ellen.A célvírusokat különböző koncentrációjú AgNP-MHC-vel és kontrollként OH-MHC-vel (4,6 × 109 részecske/ml) kezeltük rázó inkubátorban (150 fordulat/perc, 1 óra, 25 °C).A plakk vizsgálati módszert alkalmaztuk a túlélő vírusok mérésére.Az értékek három független kísérlet átlagai ± standard eltérések (SD).A csillagok jelentősen eltérő értékeket jelölnek (P< 0,05 egyirányú ANOVA-val Dunnett-teszttel).

Ez a tanulmány kimutatta, hogy az AgNP-MHC-k hatékonyan inaktiválják a bakteriofágokat és az MNV-t, amely a humán norovírus helyettesítője a vízben.Ezenkívül az AgNP-MHC-k mágnessel könnyen kinyerhetők, hatékonyan megakadályozva a potenciálisan toxikus AgNP-k környezetbe jutását.Számos korábbi tanulmány kimutatta, hogy az AgNP-k koncentrációja és részecskemérete kritikus tényező a célzott mikroorganizmusok inaktiválásához.8,16,17).Az AgNP-k antimikrobiális hatása a mikroorganizmus típusától is függ.Az AgNP-MHC-k hatékonysága a ϕX174 inaktiválására dózis-válasz összefüggést követett.A tesztelt AgNP-MHC-k közül az Ag30-MHC-k nagyobb hatékonysággal inaktiválták a ϕX174-et és az MNV-t.Az MNV esetében csak az Ag30-MHC mutatott vírusellenes aktivitást, a többi AgNP-MHC nem okozta az MNV jelentős inaktiválását.Az AgNP-MHC egyikének sem volt jelentős vírusellenes hatása az AdV2-vel szemben.

A részecskeméret mellett az ezüst koncentrációja is fontos volt az AgNP-MHC-kban.Úgy tűnt, hogy az ezüst koncentrációja meghatározza az AgNP-MHC vírusellenes hatásának hatékonyságát.Az ezüstkoncentráció az Ag07-MHC és Ag30-MHC oldatában 4,6 × 109 részecske/ml-nél 28,75 ppm, illetve 200 ppm volt, és korrelált a vírusellenes aktivitás szintjével.2. táblázatösszefoglalja a vizsgált AgNP-MHC-k ezüstkoncentrációját és felületét.Az Ag07-MHC-k mutatták a legalacsonyabb antivirális aktivitást, és a legalacsonyabb ezüstkoncentrációval és felülettel rendelkeztek, ami arra utal, hogy ezek a tulajdonságok az AgNP-MHC-k antivirális aktivitásával kapcsolatosak.

Korábbi tanulmányunk kimutatta, hogy az AgNP-MHC-k fő antimikrobiális mechanizmusai a Mg2+ vagy Ca2+ ionok kémiai elvonása a mikroba membránokból, komplexek létrehozása a membránokon elhelyezkedő tiolcsoportokkal, valamint reaktív oxigénfajták (ROS) keletkezése.21).Mivel az AgNP-MHC-k részecskemérete viszonylag nagy (~500 nm), nem valószínű, hogy át tudnak hatolni egy víruskapszidon.Ehelyett úgy tűnik, hogy az AgNP-MHC-k kölcsönhatásba lépnek a vírus felszíni fehérjéivel.A kompozitokon található AgNP-k hajlamosak megkötni a vírusok köpenyfehérjéibe ágyazott tiolcsoportot tartalmazó biomolekulákat.Ezért a virális kapszidfehérjék biokémiai tulajdonságai fontosak az AgNP-MHC-kkal szembeni érzékenységük meghatározásához.1.ábrabemutatja a vírusok eltérő érzékenységét az AgNP-MHC-k hatásaira.A ϕX174 és MNV bakteriofágok érzékenyek voltak az AgNP-MHC-kra, de az AdV2 rezisztens volt.Az AdV2 magas ellenállási szintje valószínűleg a méretével és szerkezetével függ össze.Az adenovírusok mérete 70 és 100 nm között van.30), így sokkal nagyobbak, mint a ϕX174 (27-33 nm) és az MNV (28-35 nm) (31,32).A nagy méretük mellett az adenovírusok – más vírusokkal ellentétben – kettős szálú DNS-sel rendelkeznek, és ellenállnak a különféle környezeti terheléseknek, mint például a hőnek és az UV sugárzásnak.33,34).Korábbi tanulmányunk arról számolt be, hogy az MS2 szinte 3-log10 csökkenése következett be Ag30-MHC-k hatására 6 órán belül (21).Az MS2 és a ϕX174 hasonló méretűek különböző típusú nukleinsavakkal (RNS vagy DNS), de hasonló az Ag30-MHC-k általi inaktiválási sebességük.Ezért úgy tűnik, hogy a nukleinsav természete nem az AgNP-MHC-kkel szembeni rezisztencia fő tényezője.Ehelyett a vírusrészecske mérete és alakja fontosabbnak tűnt, mivel az adenovírus sokkal nagyobb vírus.Az Ag30-MHC-k közel 2-log10-rel csökkentették az M13-at 6 órán belül (nem publikált adataink).Az M13 egyszálú DNS-vírus (35) és körülbelül 880 nm hosszú és 6,6 nm átmérőjű (36).Az M13 fonalas bakteriofág inaktiválási sebessége közepes volt a kis, kerek szerkezetű vírusoké (MNV, ϕX174 és MS2) és egy nagy vírus (AdV2) között.

Jelen tanulmányban az MNV inaktivációs kinetikája szignifikánsan különbözött a plakk-tesztben és az RT-PCR-vizsgálatban.2b. ábraésésc).c).Ismeretes, hogy a molekuláris vizsgálatok, például az RT-PCR jelentősen alábecsülik a vírusok inaktivációs arányát (25,28), amint azt tanulmányunkban megállapítottuk.Mivel az AgNP-MHC-k elsősorban a vírus felszínével lépnek kölcsönhatásba, nagyobb valószínűséggel károsítják a vírus burokfehérjét, nem pedig a vírus nukleinsavait.Ezért a virális nukleinsav mérésére szolgáló RT-PCR vizsgálat jelentősen alábecsülheti a vírusok inaktivációját.A vizsgált vírusok inaktiválásáért az Ag+ ionok hatása és a reaktív oxigénfajták (ROS) képződése kell, hogy legyen felelős.Az AgNP-MHC-k antivirális mechanizmusának számos vonatkozása azonban még mindig tisztázatlan, és további biotechnológiai megközelítéseket alkalmazó kutatásra van szükség az AdV2 magas rezisztenciájának mechanizmusának tisztázásához.

Végül értékeltük az Ag30-MHC vírusellenes aktivitásának robusztusságát oly módon, hogy pH-értékek széles tartományának, valamint csap- és felszíni vízmintáknak tettük ki őket, mielőtt megmérnénk az antivirális aktivitásukat.3. ábraésés 4).4).A rendkívül alacsony pH-értéknek való kitettség az AgNP-k fizikai és/vagy funkcionális elvesztését eredményezte az MHC-ből (nem publikált adatok).Nem specifikus részecskék jelenlétében az Ag30-MHC-k következetesen antivirális aktivitást mutattak, annak ellenére, hogy az MS2-vel szembeni antivirális aktivitás csökkent.Az antivirális aktivitás a szűretlen felszíni vízben volt a legalacsonyabb, mivel az Ag30-MHC-k és a nem specifikus részecskék közötti kölcsönhatás az erősen zavaros felszíni vízben valószínűleg az antivirális aktivitás csökkenését okozta.3. táblázat).Ezért a jövőben el kell végezni az AgNP-MHC-k helyszíni értékelését különböző típusú (pl. eltérő sókoncentrációjú vagy huminsav-tartalmú) vizekben.

Összefoglalva, az új Ag kompozitok, az AgNP-MHC-k kiváló antivirális képességekkel rendelkeznek számos vírus ellen, köztük a ϕX174 és az MNV ellen.Az AgNP-MHC-k erős hatékonyságot tartanak fenn különböző környezeti feltételek mellett, és ezek a részecskék mágnessel könnyen kinyerhetők, így csökkentve az emberi egészségre és a környezetre gyakorolt ​​lehetséges káros hatásaikat.Ez a tanulmány kimutatta, hogy az AgNP kompozit hatékony vírusellenes szer lehet különféle környezeti körülmények között, jelentős ökológiai kockázatok nélkül.