Le nanoparticelle d'argento (AgNP) sono considerate uno strumento potenzialmente utile per controllare vari agenti patogeni.Tuttavia, vi sono preoccupazioni circa il rilascio di AgNP nei mezzi ambientali, poiché potrebbero generare effetti nocivi sulla salute umana e sull’ambiente.In questo studio, abbiamo sviluppato e valutato un nuovo colloide ibrido magnetico (MHC) di dimensioni micrometriche decorato con AgNP di varie dimensioni (AgNP-MHC).Dopo essere state applicate per la disinfezione, queste particelle possono essere facilmente recuperate dai mezzi ambientali sfruttando le loro proprietà magnetiche e rimangono efficaci per inattivare gli agenti patogeni virali.Abbiamo valutato l'efficacia degli AgNP-MHC per inattivare il batteriofago ϕX174, il norovirus murino (MNV) e l'adenovirus sierotipo 2 (AdV2).Questi virus bersaglio sono stati esposti agli AgNP-MHC per 1, 3 e 6 ore a 25°C e quindi analizzati mediante test su placca e PCR TaqMan in tempo reale.Gli AgNP-MHC sono stati esposti a un'ampia gamma di livelli di pH e all'acqua del rubinetto e di superficie per valutare i loro effetti antivirali in diverse condizioni ambientali.Tra i tre tipi di AgNP-MHC testati, gli Ag30-MHC hanno mostrato la massima efficacia nell’inattivare i virus.Il ϕX174 e il MNV sono stati ridotti di oltre 2 log10 dopo l'esposizione a 4,6 × 109 Ag30-MHC/ml per 1 ora.Questi risultati hanno indicato che gli AgNP-MHC potrebbero essere utilizzati per inattivare i patogeni virali con una probabilità minima di potenziale rilascio nell'ambiente.

Con i recenti progressi nel campo delle nanotecnologie, le nanoparticelle hanno ricevuto crescente attenzione in tutto il mondo nei campi della biotecnologia, della medicina e della sanità pubblica.1,2).A causa del loro elevato rapporto superficie-volume, i materiali di dimensioni nanometriche, tipicamente compresi tra 10 e 500 nm, hanno proprietà fisico-chimiche uniche rispetto a quelle dei materiali più grandi (1).La forma e la dimensione dei nanomateriali possono essere controllate e gruppi funzionali specifici possono essere coniugati sulle loro superfici per consentire interazioni con determinate proteine ​​o assorbimento intracellulare (3,–5).

Le nanoparticelle d’argento (AgNP) sono state ampiamente studiate come agente antimicrobico (6).L'argento è utilizzato nella creazione di posate pregiate, per ornamenti e in agenti terapeutici.I composti dell'argento come la sulfadiazina d'argento e alcuni sali sono stati utilizzati come prodotti per la cura delle ferite e come trattamenti per le malattie infettive grazie alle loro proprietà antimicrobiche (6,7).Studi recenti hanno rivelato che le AgNP sono molto efficaci per inattivare vari tipi di batteri e virus (8,–11).Le AgNP e gli ioni Ag+ rilasciati dalle AgNP interagiscono direttamente con le biomolecole contenenti fosforo o zolfo, inclusi DNA, RNA e proteine ​​(12,–14).È stato anche dimostrato che generano specie reattive dell'ossigeno (ROS), causando danni alla membrana nei microrganismi (15).Anche la dimensione, la forma e la concentrazione delle AgNP sono fattori importanti che influenzano le loro capacità antimicrobiche (8,10,13,16,17).

Studi precedenti hanno anche evidenziato diversi problemi quando gli AgNP vengono utilizzati per controllare gli agenti patogeni in un ambiente acquatico.Innanzitutto, gli studi esistenti sull’efficacia delle AgNP nell’inattivazione dei patogeni virali nell’acqua sono limitati.Inoltre, le AgNP monodisperse sono tipicamente soggette ad aggregazione particella-particella a causa delle loro piccole dimensioni e dell’ampia area superficiale, e questi aggregati riducono l’efficacia delle AgNP contro i patogeni microbici.7).Infine, è stato dimostrato che gli AgNP hanno vari effetti citotossici (5,18,–20) e il rilascio di AgNP in un ambiente acquatico potrebbe comportare problemi ecologici e per la salute umana.

Recentemente, abbiamo sviluppato un nuovo colloide ibrido magnetico (MHC) di dimensioni micrometriche decorato con AgNP di varie dimensioni (21,22).Il nucleo MHC può essere utilizzato per recuperare i compositi AgNP dall'ambiente.Abbiamo valutato l'efficacia antivirale di queste nanoparticelle d'argento sugli MHC (AgNP-MHC) utilizzando il batteriofago ϕX174, il norovirus murino (MNV) e l'adenovirus in diverse condizioni ambientali.

Effetti antivirali degli AgNP-MHC a varie concentrazioni contro il batteriofago ϕX174 (a), MNV (b) e AdV2 (c).I virus target sono stati trattati con diverse concentrazioni di AgNP-MHC e con OH-MHC (4,6 × 109 particelle/ml) come controllo, in un incubatore con agitazione (150 giri al minuto, 1 ora, 25°C).Il metodo del test della placca è stato utilizzato per misurare i virus sopravvissuti.I valori sono medie ± deviazioni standard (SD) di tre esperimenti indipendenti.Gli asterischi indicano valori significativamente diversi (P< 0,05 mediante ANOVA unidirezionale con il test di Dunnett).

Questo studio ha dimostrato che gli AgNP-MHC sono efficaci per inattivare i batteriofagi e l'MNV, un surrogato del norovirus umano, nell'acqua.Inoltre, gli AgNP-MHC possono essere facilmente recuperati con un magnete, prevenendo efficacemente il rilascio di AgNP potenzialmente tossici nell'ambiente.Numerosi studi precedenti hanno dimostrato che la concentrazione e la dimensione delle particelle di AgNP sono fattori critici per l’inattivazione del microrganismo bersaglio (8,16,17).Gli effetti antimicrobici degli AgNP dipendono anche dal tipo di microrganismo.L'efficacia degli AgNP-MHC per l'inattivazione di ϕX174 ha seguito una relazione dose-risposta.Tra gli AgNP-MHC testati, gli Ag30-MHC hanno avuto un'efficacia maggiore nell'inattivazione di ϕX174 e MNV.Per MNV, solo gli Ag30-MHC hanno mostrato attività antivirale, mentre gli altri AgNP-MHC non hanno generato alcuna inattivazione significativa di MNV.Nessuno degli AgNP-MHC ha avuto alcuna attività antivirale significativa contro l'AdV2.

Oltre alla dimensione delle particelle, era importante anche la concentrazione di argento negli AgNP-MHC.La concentrazione di argento sembrava determinare l’efficacia degli effetti antivirali degli AgNP-MHC.Le concentrazioni di argento nelle soluzioni di Ag07-MHC e Ag30-MHC a 4,6 × 109 particelle/ml erano rispettivamente di 28,75 ppm e 200 ppm e erano correlate al livello di attività antivirale.Tavolo 2riassume le concentrazioni di argento e le aree superficiali degli AgNP-MHC testati.Gli Ag07-MHC hanno mostrato l'attività antivirale più bassa e avevano la concentrazione di argento e l'area superficiale più basse, suggerendo che queste proprietà sono correlate all'attività antivirale degli AgNP-MHC.

Il nostro studio precedente ha indicato che i principali meccanismi antimicrobici degli AgNP-MHC sono l’estrazione chimica di ioni Mg2+ o Ca2+ dalle membrane microbiche, la creazione di complessi con gruppi tiolici localizzati sulle membrane e la generazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) (21).Poiché gli AgNP-MHC hanno una dimensione delle particelle relativamente grande (~ 500 nm), è improbabile che possano penetrare in un capside virale.Invece, gli AgNP-MHC sembrano interagire con le proteine ​​​​della superficie virale.Gli AgNP sui compositi tendono a legare le biomolecole contenenti gruppi tiolici incorporate nelle proteine ​​di rivestimento dei virus.Pertanto, le proprietà biochimiche delle proteine ​​del capside virale sono importanti per determinare la loro suscettibilità agli AgNP-MHC.Figura 1mostra la diversa suscettibilità dei virus agli effetti degli AgNP-MHC.I batteriofagi ϕX174 e MNV erano sensibili agli AgNP-MHC, ma AdV2 era resistente.È probabile che l'elevato livello di resistenza di AdV2 sia associato alle sue dimensioni e struttura.Le dimensioni degli adenovirus variano da 70 a 100 nm (30), rendendoli molto più grandi di ϕX174 (da 27 a 33 nm) e MNV (da 28 a 35 nm) (31,32).Oltre alle loro grandi dimensioni, gli adenovirus hanno un DNA a doppio filamento, a differenza di altri virus, e sono resistenti a vari stress ambientali come il calore e le radiazioni UV (33,34).Il nostro studio precedente ha riportato che si è verificata una riduzione di quasi 3 log10 di MS2 con Ag30-MHC entro 6 ore (21).MS2 e ϕX174 hanno dimensioni simili con diversi tipi di acido nucleico (RNA o DNA) ma hanno tassi simili di inattivazione da parte degli Ag30-MHC.Pertanto, la natura dell'acido nucleico non sembra essere il principale fattore di resistenza agli AgNP-MHC.Invece, la dimensione e la forma della particella virale sembravano essere più importanti, perché l’adenovirus è un virus molto più grande.Gli Ag30-MHC hanno ottenuto una riduzione di quasi 2 log10 di M13 entro 6 ore (i nostri dati non pubblicati).M13 è un virus a DNA a filamento singolo (35) ed è lungo circa 880 nm e ha un diametro di 6,6 nm (36).La velocità di inattivazione del batteriofago filamentoso M13 era intermedia tra quella dei virus piccoli e a struttura rotonda (MNV, ϕX174 e MS2) e dei virus grandi (AdV2).

Nel presente studio, la cinetica di inattivazione del MNV era significativamente diversa nel test su placca e nel test RT-PCR (Figura 2bE​ecc).c).È noto che i test molecolari come la RT-PCR sottostimano significativamente i tassi di inattivazione dei virus (25,28), come è stato riscontrato nel nostro studio.Poiché gli AgNP-MHC interagiscono principalmente con la superficie virale, è più probabile che danneggino le proteine ​​del rivestimento virale piuttosto che gli acidi nucleici virali.Pertanto, un test RT-PCR per misurare l’acido nucleico virale può sottostimare significativamente l’inattivazione dei virus.L'effetto degli ioni Ag+ e la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) dovrebbero essere responsabili dell'inattivazione dei virus testati.Tuttavia, molti aspetti dei meccanismi antivirali degli AgNP-MHC non sono ancora chiari e sono necessarie ulteriori ricerche che utilizzino approcci biotecnologici per chiarire il meccanismo dell'elevata resistenza di AdV2.

Infine, abbiamo valutato la robustezza dell’attività antivirale degli Ag30-MHC esponendoli a un ampio intervallo di valori di pH e a campioni di acqua di rubinetto e di superficie prima di misurare la loro attività antivirale (Figura 3Ee4).4).L'esposizione a condizioni di pH estremamente basso ha comportato la perdita fisica e/o funzionale delle AgNP dall'MHC (dati non pubblicati).In presenza di particelle non specifiche, gli Ag30-MHC mostravano costantemente attività antivirale, nonostante un declino dell’attività antivirale contro MS2.L’attività antivirale era più bassa nelle acque superficiali non filtrate, poiché un’interazione tra Ag30-MHC e particelle non specifiche nell’acqua superficiale altamente torbida probabilmente causava una riduzione dell’attività antivirale.Tabella 3).Pertanto, in futuro dovrebbero essere eseguite valutazioni sul campo degli AgNP-MHC in vari tipi di acqua (ad esempio, con diverse concentrazioni di sale o acido umico).

In conclusione, i nuovi compositi Ag, AgNP-MHC, hanno eccellenti capacità antivirali contro diversi virus, tra cui ϕX174 e MNV.Gli AgNP-MHC mantengono una forte efficacia in diverse condizioni ambientali e queste particelle possono essere facilmente recuperate utilizzando un magnete, riducendo così i loro potenziali effetti dannosi sulla salute umana e sull'ambiente.Questo studio ha dimostrato che il composito AgNP può essere un antivirale efficace in vari contesti ambientali, senza rischi ecologici significativi.