Javascript מושבת כעת בדפדפן שלך.כאשר javascript מושבת, חלק מהפונקציות של אתר זה לא יפעלו.
רשום את הפרטים הספציפיים שלך ותרופות ספציפיות לעניין, ואנו נתאים את המידע שאתה מספק למאמרים במאגר המידע הנרחב שלנו ונשלח לך עותק PDF בדוא"ל בזמן.
האם ננו-חלקיקים קטנים יותר תמיד טובים יותר?להבין את ההשפעות הביולוגיות של צבירה תלוית גודל של ננו-חלקיקי כסף בתנאים רלוונטיים ביולוגית
מחברים: Bélteky P, Rónavári A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Kónya Z
Péter Bélteky,1,* Andrea Rónavári,1,* Dalma Zakupszky,1 Eszter Boka,1 Nóra Igaz,2 Bettina Szerencsés,3 Ilona Pfeiffer,3 Csaba Vágvölgyi,3 Mónika Kiricsi מכימיה סביבתית, הונגריה, הפקולטה למדע ואיפורמטיקה בהונגריה. , אוניברסיטת סגד;2 המחלקה לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית, הפקולטה למדע ומידע, אוניברסיטת סגד, הונגריה;3 המחלקה למיקרוביולוגיה, הפקולטה למדע ומידע, אוניברסיטת סגד, הונגריה;4MTA-SZTE Reaction Kinetics and Surface Chemistry Group Research Group, Szeged, הונגריה* מחברים אלה תרמו באותה מידה לעבודה זו.תקשורת: Zoltán Kónya המחלקה לכימיה יישומית וסביבה, הפקולטה למדעים ואינפורמטיקה, אוניברסיטת Szeged, Rerrich Square 1, Szeged, H-6720, Hungary טלפון +36 62 544620 דוא"ל [הגנה על דואר אלקטרוני] מטרה: ננו-חלקיקי כסף (AgNPs) הם אחד הננו-חומרים הנלמדים ביותר, במיוחד בשל היישומים הביו-רפואיים שלהם.עם זאת, עקב הצטברות של ננו-חלקיקים, הציטוטוקסיות המצוינת והפעילות האנטיבקטריאלית שלהם נפגעות לעתים קרובות במדיה ביולוגית.בעבודה זו נחקרו התנהגות הצבירה ופעילויות ביולוגיות קשורות של שלוש דגימות ננו-חלקיקי כסף עם סיום ציטראט שונים בקוטר ממוצע של 10, 20 ו-50 ננומטר.שיטה: השתמש במיקרוסקופ אלקטרוני תמסורת כדי לסנתז ולאפיין ננו-חלקיקים, להעריך את התנהגות הצבירה שלהם בערכי pH שונים, ריכוזי NaCl, גלוקוז וגלוטמין על ידי פיזור אור דינמי וספקטרוסקופיה הנראית לעין אולטרה סגול.בנוסף, במדיום תרבית תאים רכיבים כגון Dulbecco משפרים את התנהגות הצבירה בסרום עגל של Eagle Medium ו-Fetal Calf.תוצאות: התוצאות מראות ש-pH חומצי ותכולת אלקטרוליטים פיזיולוגיים גורמים בדרך כלל לצבירה בקנה מידה מיקרוני, שיכולה להיות מתווך על ידי היווצרות קורונה ביומולקולרית.ראוי לציין שחלקיקים גדולים יותר מפגינים עמידות גבוהה יותר להשפעות חיצוניות מאשר מקביליהם הקטנים יותר.בדיקות ציטוטוקסיות במבחנה ובדיקות אנטיבקטריאליות בוצעו על ידי טיפול בתאים עם אגרגטים של ננו-חלקיקים בשלבי צבירה שונים.מסקנה: התוצאות שלנו חושפות מתאם עמוק בין יציבות קולואידית לרעילות של AgNPs, שכן צבירה קיצונית מובילה לאובדן מוחלט של פעילות ביולוגית.לדרגה הגבוהה יותר של אנטי-אגרגציה שנצפתה עבור חלקיקים גדולים יותר יש השפעה משמעותית על הרעילות במבחנה, מכיוון שדגימות כאלה שומרות יותר פעילות אנטי-מיקרוביאלית ויונקים.ממצאים אלו מובילים למסקנה שלמרות הדעה הכללית בספרות הרלוונטית, התמקדות בננו-חלקיקים הקטנים ביותר האפשריים לא יכולה להיות דרך הפעולה הטובה ביותר.מילות מפתח: צמיחה מתווכת זרע, יציבות קולואידית, התנהגות צבירה תלוית גודל, רעילות נזקי צבירה
ככל שהביקוש והתפוקה של ננו-חומרים ממשיכים לגדול, יותר ויותר תשומת לב מוקדשת לבטיחות הביולוגית או לפעילות הביולוגית שלהם.ננו-חלקיקי כסף (AgNPs) הם אחד הנציגים הנפוצים ביותר המסונתזים, הנחקרים והמנוצלים ביותר של סוג זה של חומרים בגלל התכונות הקטליטיות, האופטיות והביולוגיות המצוינות שלהם.1 מקובל להאמין שהמאפיינים הייחודיים של ננו-חומרים (כולל AgNPs) מיוחסים בעיקר לשטח הפנים הספציפי הגדול שלהם.לכן, הבעיה בהכרח היא כל תהליך שמשפיע על תכונת מפתח זו, כגון גודל חלקיקים, ציפוי פני השטח או צבירה, האם זה יפגע קשות במאפיינים של ננו-חלקיקים שהם קריטיים ליישומים ספציפיים.
ההשפעות של גודל החלקיקים והמייצבים הם נושאים שתועדו היטב בספרות.לדוגמה, הדעה המקובלת היא שננו-חלקיקים קטנים יותר רעילים יותר מננו-חלקיקים גדולים יותר.2 בהתאם לספרות הכללית, המחקרים הקודמים שלנו הוכיחו את הפעילות התלויה בגודל של ננו-כסף על תאי יונקים ומיקרואורגניזמים.3-5 ציפוי פני השטח הוא תכונה נוספת שיש לה השפעה רחבה על המאפיינים של ננו-חומרים.רק על ידי הוספת או שינוי מייצבים על פני השטח שלו, אותו ננו-חומר עשוי להיות בעל תכונות פיזיקליות, כימיות וביולוגיות שונות לחלוטין.היישום של סוכני מכסה מבוצע לרוב כחלק מסינתזת ננו-חלקיקים.לדוגמה, ננו-חלקיקי כסף עם סיום ציטראט הם אחד מה-AgNPs הרלוונטיים ביותר במחקר, אשר מסונתזים על ידי הפחתת מלחי כסף בתמיסת מייצב נבחרה כמדיום התגובה.6 ציטראט יכול בקלות לנצל את העלות הנמוכה שלו, הזמינות, התאימות הביולוגית והזיקה החזקה לכסף, שיכולה לבוא לידי ביטוי באינטראקציות מוצעות שונות, החל מספיחת משטח הפיך ועד לאינטראקציות יוניות.מולקולות קטנות ויונים פוליאטומיים ליד 7,8, כגון ציטראטים, פולימרים, פוליאלקטרוליטים וחומרים ביולוגיים משמשים גם הם בדרך כלל לייצוב ננו-כסף ולביצוע פונקציונליזציות ייחודיות עליו.9-12
למרות שהאפשרות לשנות את הפעילות של ננו-חלקיקים על ידי מכסה מכוון של פני השטח היא אזור מעניין מאוד, התפקיד העיקרי של ציפוי פני השטח הזה הוא זניח, ומספק יציבות קולואידית למערכת הננו-חלקיקים.שטח הפנים הספציפי הגדול של ננו-חומרים יפיק אנרגיית שטח גדולה, מה שמפריע ליכולת התרמודינמית של המערכת להגיע לאנרגיה המינימלית שלה.13 ללא ייצוב מתאים, זה יכול להוביל להצטברות של ננו-חומרים.אגרגציה היא היווצרות של אגרגטים של חלקיקים בצורות וגדלים שונים המתרחשת כאשר חלקיקים מפוזרים נפגשים ואינטראקציות תרמודינמיות נוכחיות מאפשרות לחלקיקים להיצמד זה לזה.לכן, מייצבים משמשים למניעת צבירה על ידי החדרת כוח דחייה גדול מספיק בין החלקיקים כדי לנטרל את המשיכה התרמודינמית שלהם.14
למרות שהנושא של גודל החלקיקים וכיסוי פני השטח נחקר ביסודיות בהקשר של ויסות הפעילויות הביולוגיות שלו המופעלות על ידי ננו-חלקיקים, צבירת חלקיקים היא אזור מוזנח במידה רבה.אין כמעט מחקר יסודי לפתרון היציבות הקולואידית של ננו-חלקיקים בתנאים רלוונטיים ביולוגית.10,15-17 בנוסף, תרומה זו נדירה במיוחד, כאשר גם הרעילות הקשורה לצבירה נחקרה, גם אם היא עלולה לגרום לתגובות שליליות, כגון פקקת כלי דם, או אובדן מאפיינים רצויים, כגון רעילותה, כמו מוצג באיור 1.18, 19 מוצג.למעשה, אחד המנגנונים הבודדים של עמידות לננו-חלקיקי כסף קשור לצבירה, מכיוון שדווח כי זני E. coli ו-Pseudomonas aeruginosa מסוימים מפחיתים את רגישותם לננו-כסף על ידי ביטוי החלבון flagellin, flagellin.יש לו זיקה גבוהה לכסף, ובכך מעורר צבירה.20
ישנם מספר מנגנונים שונים הקשורים לרעילות של ננו-חלקיקי כסף, והצטברות משפיעה על כל המנגנונים הללו.השיטה הנדונה ביותר לפעילות ביולוגית של AgNP, המכונה לעתים מנגנון "הסוס הטרויאני", מתייחסת ל-AgNPs כנשאי Ag+.1,21 מנגנון הסוס הטרויאני יכול להבטיח עלייה גדולה בריכוז Ag+ המקומי, מה שמוביל ליצירת ROS ודפולריזציה של הממברנה.22-24 צבירה עשויה להשפיע על שחרור Ag+, ובכך להשפיע על הרעילות, מכיוון שהיא מפחיתה את המשטח הפעיל היעיל שבו יוני כסף עלולים להתחמצן ולהתמוסס.עם זאת, AgNPs לא רק יפגינו רעילות באמצעות שחרור יונים.יש לקחת בחשבון אינטראקציות רבות הקשורות לגודל ולמורפולוגיה.ביניהם, הגודל והצורה של משטח הננו-חלקיקים הם המאפיינים המגדירים.4,25 ניתן לסווג את אוסף המנגנונים הללו כ"מנגנוני רעילות המושרים".ישנן תגובות פוטנציאליות רבות של המיטוכונדריה והממברנות המשטחיות שעלולות לפגוע באברונים ולגרום למוות של תאים.25-27 מאחר והיווצרות אגרגטים משפיעה באופן טבעי על הגודל והצורה של עצמים המכילים כסף המוכרים על ידי מערכות חיות, אינטראקציות אלו עשויות להיות מושפעות גם הן.
במאמר הקודם שלנו על צבירה של ננו-חלקיקי כסף, הדגמנו הליך סקר יעיל המורכב מניסויים כימיים וביולוגיים במבחנה כדי לחקור בעיה זו.19 פיזור אור דינמי (DLS) היא הטכניקה המועדפת לסוגים אלה של בדיקות מכיוון שהחומר יכול לפזר פוטונים באורך גל השווה לגודל החלקיקים שלו.מכיוון שמהירות התנועה הבראונית של חלקיקים בתווך הנוזלי קשורה לגודל, ניתן להשתמש בשינוי בעוצמת האור המפוזר כדי לקבוע את הקוטר ההידרודינמי הממוצע (Z-mean) של דגימת הנוזל.28 בנוסף, על ידי הפעלת מתח על המדגם, ניתן למדוד את פוטנציאל הזטה (פוטנציאל ζ) של הננו-חלקיק בדומה לערך הממוצע Z.13,28 אם הערך המוחלט של פוטנציאל הזטה גבוה מספיק (לפי הנחיות כלליות> ±30 mV), הוא יפיק דחייה אלקטרוסטטית חזקה בין החלקיקים כדי לנטרל את הצבירה.תהודה פלסמונית אופיינית (SPR) היא תופעה אופטית ייחודית המיוחסת בעיקר לננו-חלקיקי מתכת יקרים (בעיקר Au ו-Ag).29​​ בהתבסס על התנודות האלקטרוניות (פלסמונות פני השטח) של חומרים אלה בקנה מידה ננומטרי, ידוע של-AgNPs כדוריים יש שיא ספיגה אופייני של UV-Vis ליד 400 ננומטר.30 עוצמת ואורך הגל של החלקיקים משמשים כדי להשלים את תוצאות ה-DLS, שכן ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לזהות צבירת ננו-חלקיקים וספיחת פני השטח של ביו-מולקולות.
בהתבסס על המידע שהתקבל, מבוצעות מבחני חיוניות תאים (MTT) ומבחנים אנטיבקטריאליים באופן שבו רעילות AgNP מתוארת כפונקציה של רמת הצבירה, ולא (הגורם הנפוץ ביותר בשימוש) ריכוז ננו-חלקיקים.שיטה ייחודית זו מאפשרת לנו להדגים את החשיבות העמוקה של רמת צבירה בפעילות ביולוגית, מכיוון, למשל, AgNPs עם סיום ציטראט מאבדים לחלוטין את פעילותם הביולוגית תוך מספר שעות עקב צבירה.19
בעבודה הנוכחית, אנו שואפים להרחיב מאוד את התרומות הקודמות שלנו ביציבות של קולואידים הקשורים ביולוגית והשפעתם על פעילות ביולוגית על ידי לימוד ההשפעה של גודל ננו-חלקיקים על צבירת ננו-חלקיקים.זהו ללא ספק אחד המחקרים של ננו-חלקיקים.פרספקטיבה בעלת פרופיל גבוה יותר ו-31 כדי לחקור נושא זה, נעשה שימוש בשיטת גידול בתיווך זרעים לייצור AgNPs עם סיום ציטראט בשלושה טווחי גדלים שונים (10, 20 ו-50 ננומטר).6,32 כאחת השיטות הנפוצות ביותר.עבור ננו-חומרים הנמצאים בשימוש נרחב ושגרתי ביישומים רפואיים, נבחרים AgNP עם סיום ציטראט בגדלים שונים כדי לחקור את התלות האפשרית בגודל של התכונות הביולוגיות הקשורות לצבירה של ננו-כסף.לאחר סינתזה של AgNPs בגדלים שונים, אפיינו את הדגימות שהופקו על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים העברה (TEM), ולאחר מכן בדקנו את החלקיקים באמצעות הליך ההקרנה האמור לעיל.בנוסף, בנוכחות תרביות תאים במבחנה Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) וסרום בקר עוברי (FBS), התנהגות הצבירה תלוית הגודל והתנהגותה הוערכה בערכי pH שונים, NaCl, גלוקוז וגלוטמין.המאפיינים של ציטוטוקסיות נקבעים בתנאים מקיפים.הקונצנזוס המדעי מצביע על כך שבאופן כללי, עדיפים חלקיקים קטנים יותר;החקירה שלנו מספקת פלטפורמה כימית וביולוגית כדי לקבוע אם זה המקרה.
שלושה ננו-חלקיקי כסף בטווחי גדלים שונים הוכנו בשיטת הגידול בתיווך זרעים שהוצעה על ידי Wan וחב', עם התאמות קלות.6 שיטה זו מבוססת על הפחתה כימית, תוך שימוש בחנקת כסף (AgNO3) כמקור הכסף, נתרן בוורוהידריד (NaBH4) כחומר המפחית, ונתרן ציטראט כמייצב.ראשית, הכינו 75 מ"ל של תמיסה מימית של ציטראט 9 מ"מ מנתרן ציטראט דיהידראט (Na3C6H5O7 x 2H2O) וחממו ל-70 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, 2 מ"ל של תמיסת 1% w/v AgNO3 נוספה למדיום התגובה, ולאחר מכן תמיסת הנתרן בורוהיריד שהוכנה טרי (2 מ"ל 0.1% w/v) נשפכה לתוך התערובת טיפה.התרחיף הצהוב-חום שהתקבל נשמר ב-70 מעלות צלזיוס תוך ערבוב נמרץ למשך שעה, ולאחר מכן מקורר לטמפרטורת החדר.המדגם המתקבל (המכונה AgNP-I מעתה ואילך) משמש כבסיס לצמיחה בתיווך זרע בשלב הסינתזה הבא.
כדי לסנתז תרחיף חלקיקים בגודל בינוני (מסומן כ-AgNP-II), מחממים 90 מ"ל 7.6 מ"ל ציטראט ל-80 מעלות צלזיוס, מערבבים אותה עם 10 מ"ל AgNP-I, ואז מערבבים 2 מ"ל 1% w/v תמיסת AgNO3 נשמר תחת ערבוב מכני נמרץ במשך שעה אחת, ולאחר מכן הדגימה צוננה לטמפרטורת החדר.
עבור החלקיק הגדול ביותר (AgNP-III), חזור על אותו תהליך גידול, אך במקרה זה, השתמש ב-10 מ"ל של AgNP-II כהשעיית הזרעים.לאחר שהדגימות מגיעות לטמפרטורת החדר, הן קובעות את ריכוז ה-Ag הנומינלי שלהן בהתבסס על תכולת AgNO3 הכוללת ל-150 ppm על ידי הוספה או אידוי של ממס נוסף ב-40°C, ולבסוף מאחסנים אותן ב-4°C עד לשימוש נוסף.
השתמש במיקרוסקופ אלקטרוני תמסורת של FEI Tecnai G2 20 X-Twin (TEM) (מטה תאגידי של FEI, Hillsboro, אורגון, ארה"ב) עם מתח האצה של 200 קילוואט כדי לבחון את המאפיינים המורפולוגיים של ננו-חלקיקים וללכוד את דפוס עקיפות האלקטרונים שלהם (ED).לפחות 15 תמונות מייצגות (~750 חלקיקים) הוערכו באמצעות חבילת התוכנה ImageJ, וההיסטוגרמות שהתקבלו (וכל הגרפים במחקר כולו) נוצרו ב- OriginPro 2018 (OriginLab, Northampton, MA, ארה"ב) 33, 34.
הקוטר ההידרודינמי הממוצע (ממוצע Z), פוטנציאל הזטה (פוטנציאל ζ) ותהודה פלסמונית משטחית אופיינית (SPR) של הדגימות נמדדו כדי להמחיש את התכונות הקולואידליות הראשוניות שלהן.הקוטר ההידרודינמי הממוצע ופוטנציאל הזטה של ​​המדגם נמדדו על ידי מכשיר Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, בריטניה) באמצעות תאים קפילריים חד פעמיים מקופלים ב-37±0.1 מעלות צלזיוס.Ocean Optics 355 DH-2000-BAL ספקטרופוטומטר UV-Vis (Halma PLC, Largo, FL, ארה"ב) שימש להשגת מאפייני SPR אופייניים מספקטרום הספיגה של UV-Vis של דגימות בטווח של 250-800 ננומטר.
במהלך כל הניסוי, בוצעו בו-זמנית שלושה סוגי מדידה שונים הקשורים ליציבות קולואידית.השתמש ב-DLS כדי למדוד את הקוטר ההידרודינמי הממוצע (ממוצע Z) ופוטנציאל הזטה (פוטנציאל ζ) של החלקיקים, מכיוון שממוצע ה-Z קשור לגודל הממוצע של אגרגטים ננו-חלקיקים, ופוטנציאל הזטה מציין אם הדחייה האלקטרוסטטית במערכת הוא חזק מספיק כדי לקזז את המשיכה של ואן דר ואלס בין ננו-חלקיקים.המדידות מתבצעות בשלושה עותקים, וסטיית התקן של ממוצע Z ופוטנציאל זיטה מחושבת על ידי תוכנת Zetasizer.ספקטרום ה-SPR האופייניים של החלקיקים מוערכים על ידי ספקטרוסקופיה UV-Vis, מכיוון ששינויים בעוצמת השיא ובאורך הגל יכולים להצביע על צבירת ואינטראקציות פני השטח.29,35 למעשה, תהודה פלסמונית פני השטח במתכות יקרות היא כה משפיעה שהיא הובילה לשיטות חדשות לניתוח של ביומולקולות.29,36,37 ריכוז AgNPs בתערובת הניסוי הוא כ-10 ppm, והמטרה היא להגדיר את עוצמת הספיגה הראשונית המקסימלית של SPR ל-1. הניסוי בוצע באופן תלוי זמן ב-0;1.5;3;6;12 ו-24 שעות בתנאים שונים רלוונטיים ביולוגית.פרטים נוספים המתארים את הניסוי ניתן לראות בעבודה הקודמת שלנו.19 בקיצור, ערכי pH שונים (3; 5; 7.2 ו-9), ריכוזי נתרן כלורי שונים (10 מ"מ; 50 מ"מ; 150 מ"מ), גלוקוז (3.9 מ"מ; 6.7 מ"מ) וגלוטמין (4 מ"מ), וכן כמו כן הכין Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) וסרום בקר עוברי (FBS) (במים ו-DMEM) כמערכות מודל, וחקר את השפעותיהם על התנהגות הצבירה של ננו-חלקיקי הכסף המסונתזים.pH הערכים של, NaCl, גלוקוז וגלוטמין מוערכים על סמך ריכוזים פיזיולוגיים, בעוד שכמויות ה-DMEM וה-FBS זהות לרמות המשמשות בכל הניסוי במבחנה.38-42 כל המדידות בוצעו ב-pH 7.2 ו-37 מעלות צלזיוס עם ריכוז מלח רקע קבוע של 10 mM NaCl כדי לחסל כל אינטראקציה בין חלקיקים למרחקים ארוכים (למעט ניסויים מסוימים הקשורים ל-pH ו-NaCl, כאשר תכונות אלו הן המשתנים תחת לימוד).28 רשימת התנאים השונים מסוכמת בטבלה 1. הניסוי המסומן ב-† משמש כהתייחסות ומתאים לדגימה המכילה 10 mM NaCl ו-pH 7.2.
קו תאי סרטן ערמונית אנושי (DU145) וקרטינוציטים אנושיים מונצחים (HaCaT) התקבלו מ-ATCC (Manassas, VA, ארה"ב).תאים מתרבים באופן שגרתי במדיום המינימלי החיוני של Dulbecco (DMEM) המכיל 4.5 גרם/ליטר גלוקוז (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, ארה"ב), בתוספת 10% FBS, 2 מ"מ L-גלוטמין, 0.01% סטרפטומיצין ו-0.005% פניצילין (סיגמה-אלדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב).התאים עוברים תרבית באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס תחת 5% CO2 ו-95% לחות.
על מנת לחקור את השינויים בציטוטוקסיות של AgNP הנגרמת על ידי צבירה של חלקיקים באופן תלוי זמן, בוצעה בדיקת MTT דו-שלבית.ראשית, הכדאיות של שני סוגי התאים נמדדה לאחר טיפול ב-AgNP-I, AgNP-II ו-AgNP-III.לשם כך, שני סוגי התאים נזרעו לצלחות של 96 בארות בצפיפות של 10,000 תאים/באר וטופלו בשלושה גדלים שונים של ננו-חלקיקי כסף בריכוזים הולכים וגדלים ביום השני.לאחר 24 שעות של טיפול, התאים נשטפו עם PBS והודגרו עם מגיב של 0.5 מ"ג/מ"ל MTT (SERVA, Heidelberg, גרמניה) מדולל במצע תרבות למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.גבישי Formazan הומסו ב-DMSO (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, ארה"ב), והספיגה נמדדה ב-570 ננומטר באמצעות קורא לוחות Synergy HTX (BioTek-Hungary, Budapest, הונגריה).ערך הספיגה של דגימת הביקורת הלא מטופלת נחשב לשיעור הישרדות של 100%.בצע לפחות 3 ניסויים באמצעות ארבעה שכפולים ביולוגיים עצמאיים.IC50 מחושב מעקומת תגובה למינון המבוססת על תוצאות חיוניות.
לאחר מכן, בשלב השני, על ידי דגירה של החלקיקים עם 150 mM NaCl לפרקי זמן שונים (0, 1.5, 3, 6, 12 ו-24 שעות) לפני הטיפול בתאים, נוצרו מצבי צבירה שונים של ננו-חלקיקי כסף.לאחר מכן, אותו מבחן MTT בוצע כפי שתואר קודם כדי להעריך שינויים בכדאיות התא המושפע מהצטברות חלקיקים.השתמש ב-GraphPad Prism 7 כדי להעריך את התוצאה הסופית, לחשב את המובהקות הסטטיסטית של הניסוי על ידי מבחן t לא מזווג, וסמן את רמתו כ-* (p ≤ 0.05), ** (p ≤ 0.01), *** (p ≤ 0.001 ) ו**** (p ≤ 0.0001).
שלושה גדלים שונים של ננו-חלקיקי כסף (AgNP-I, AgNP-II ו-AgNP-III) שימשו עבור רגישות אנטיבקטריאלית ל-Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM; מרכז מחקר לפטריות פתוגניות וטוקסיקולוגיה של חיידקים, אוניברסיטת צ'יבה) ו-Bacillus Test megaterium SZMC 6031 (SZMC: Szeged Microbiology Collection) ו-E. coli SZMC 0582 במדיום RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Co.).על מנת להעריך את השינויים בפעילות האנטיבקטריאלית הנגרמים על ידי אגרגציה של חלקיקים, ראשית, הריכוז המעכב המינימלי שלהם (MIC) נקבע על ידי מיקרודילול בצלחת מיקרוטיטר בעלת 96 בארות.ל-50 μL של תרחיף תאים מתוקנן (5 × 104 תאים/מ"ל במדיום RPMI 1640), הוסיפו 50 μL של תרחיף ננו-חלקיקי כסף ודלל באופן סדרתי פי שניים מהריכוז (במדיום האמור לעיל, הטווח הוא 0 ו-75 ppm, כלומר, דגימת הבקרה מכילה 50 μL של תרחיף תאים ו-50 μL של מדיום ללא ננו-חלקיקים).לאחר מכן, הצלחת הודגרה ב-30 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות, והצפיפות האופטית של התרבית נמדדה ב-620 ננומטר באמצעות קורא לוחות SPECTROstar Nano (BMG LabTech, Offenburg, גרמניה).הניסוי בוצע שלוש פעמים בשלושה עותקים.
פרט לכך ש-50 μL של דגימות ננו-חלקיקים בודדים היו בשימוש בשלב זה, אותו הליך שתואר קודם לכן שימש לבחינת השפעת הצבירה על פעילות אנטיבקטריאלית על הזנים שהוזכרו לעיל.מצבי צבירה שונים של ננו-חלקיקי כסף מיוצרים על ידי דגירה של החלקיקים עם 150 mM NaCl לפרקי זמן שונים (0, 1.5, 3, 6, 12 ו-24 שעות) לפני עיבוד התא.תרחיף בתוספת של 50 μL של מדיום RPMI 1640 שימש כבקרת צמיחה, בעוד שעל מנת לשלוט על הרעילות, נעשה שימוש בתרחיף עם ננו-חלקיקים לא מצטברים.הניסוי בוצע שלוש פעמים בשלושה עותקים.השתמש ב-GraphPad Prism 7 כדי להעריך שוב את התוצאה הסופית, תוך שימוש באותו ניתוח סטטיסטי כמו ניתוח MTT.
רמת הצבירה של החלקיקים הקטנים ביותר (AgNP-I) אופיינה, והתוצאות פורסמו חלקית בעבודה הקודמת שלנו, אך לשם השוואה טובה יותר, כל החלקיקים עברו סינון יסודי.הנתונים הניסויים נאספים ונדונים בסעיפים הבאים.שלושה גדלים של AgNP.19
מדידות שבוצעו על ידי TEM, UV-Vis ו-DLS אימתו את הסינתזה המוצלחת של כל דגימות AgNP (איור 2A-D).לפי השורה הראשונה של איור 2, החלקיק הקטן ביותר (AgNP-I) מראה מורפולוגיה כדורית אחידה בקוטר ממוצע של כ-10 ננומטר.שיטת הגידול בתיווך זרעים מספקת גם ל-AgNP-II ו-AgNP-III טווחי גדלים שונים עם קטרים ​​ממוצעים של חלקיקים של כ-20 ננומטר ו-50 ננומטר, בהתאמה.על פי סטיית התקן של התפלגות החלקיקים, הגדלים של שלוש הדגימות אינם חופפים, וזה חשוב לניתוח ההשוואתי שלהם.על ידי השוואת יחס הגובה-רוחב הממוצע ויחס הדקיקות של תחזיות חלקיקים דו-ממדיות מבוססות TEM, ההנחה היא כי הכדוריות של החלקיקים מוערכת על ידי תוסף מסנן הצורה של ImageJ (איור 2E).43 על פי ניתוח צורת החלקיקים, יחס הגובה-רוחב שלהם (צד גדול/צד קצר של המלבן התוחם הקטן ביותר) אינו מושפע מצמיחת החלקיקים, ויחס הדקיקות שלהם (השטח הנמדד של המעגל המושלם/השטח התיאורטי המקביל ) יורד בהדרגה.זה גורם ליותר ויותר חלקיקים פוליהדרלים, שהם עגולים לחלוטין בתיאוריה, המקבילים ליחס רזון של 1.
איור 2 תמונת מיקרוסקופ אלקטרוני שידור (TEM) (A), תבנית עקיפה של אלקטרונים (ED) (B), היסטוגרמת התפלגות גודל (C), ספקטרום ספיגת אור אופייני לעין אולטרה סגול (UV-Vis) (D), וציטראט נוזל ממוצע -לחלקיקי כסף עם סיום עם קוטר מכני (ממוצע Z), פוטנציאל זיטה, יחס רוחב-גובה ויחס עובי (E) יש שלושה טווחי גודל שונים: AgNP-I הוא 10 ננומטר (שורה עליונה), AgNP -II הוא 20 ננומטר (שורה אמצעית ), AgNP-III (שורה תחתונה) הוא 50 ננומטר.
למרות שהטבע המחזורי של שיטת הגידול השפיע במידה מסוימת על צורת החלקיקים, וכתוצאה מכך הכדוריות הקטנה יותר של AgNPs גדולים יותר, כל שלוש הדגימות נותרו כמעט כדוריות.בנוסף, כפי שמוצג בתבנית עקיפות האלקטרונים באיור 2B, ננו הגבישיות של החלקיקים אינה מושפעת.טבעת הדיפרקציה הבולטת - שניתן לתאם עם מדדי (111), (220), (200) ו-(311) מילר של כסף - עולה בקנה אחד עם הספרות המדעית ותרומותינו הקודמות.9, 19,44 הפיצול של טבעת Debye-Scherrer של AgNP-II ו- AgNP-III נובע מכך שתמונת ה-ED נלכדת באותה הגדלה, כך שככל שגודל החלקיקים גדל, מספר החלקיקים המנותחים לכל שטח יחידת גדל ויורד.
ידוע שהגודל והצורה של ננו-חלקיקים משפיעים על הפעילות הביולוגית.3,45 פעילות קטליטית וביולוגית תלוית צורה יכולה להיות מוסברת על ידי העובדה שצורות שונות נוטות להתרבות פנים גבישים מסוימות (בעלי מדדי מילר שונים), ולפני גבישים אלו יש פעילויות שונות.45,46 מכיוון שהחלקיקים המוכנים מספקים תוצאות ED דומות המתאימות למאפייני גביש דומים מאוד, ניתן להניח שבניסויים הבאים שלנו ביציבות קולואידית ופעילות ביולוגית, יש לייחס את ההבדלים שנצפו לגודל הננו-חלקיקים, ולא לתכונות הקשורות לצורה.
תוצאות ה-UV-Vis המסוכמות באיור 2D מדגישות עוד יותר את האופי הכדורי המכריע של AgNP המסונתז, מכיוון ששיאי ה-SPR של כל שלוש הדגימות הם סביב 400 ננומטר, שהוא ערך אופייני של ננו-חלקיקי כסף כדוריים.29,30 הספקטרום שנלכד גם אישר את הצמיחה המוצלחת בתיווך זרעים של ננו-כסף.ככל שגודל החלקיקים גדל, אורך הגל המתאים לספיגת האור המקסימלית של AgNP-II-בולט יותר-לפי הספרות, AgNP-III חווה הסטה לאדום.6,29
לגבי היציבות הקולואידית הראשונית של מערכת AgNP, נעשה שימוש ב-DLS למדידת הקוטר ההידרודינמי הממוצע ופוטנציאל הזטה של ​​החלקיקים ב-pH 7.2.התוצאות המתוארות באיור 2E מראות של-AgNP-III יש יציבות קולואידית גבוהה יותר מ-AgNP-I או AgNP-II, מכיוון שהנחיות נפוצות מצביעות על כך שפוטנציאל זיטה של ​​30 mV אבסולוטי נחוץ ליציבות קולואידית ארוכת טווח. ממצא זה נתמך עוד יותר כאשר הערך הממוצע Z (שמתקבל כקוטר ההידרודינמי הממוצע של חלקיקים חופשיים ומצטברים) מושווה לגודל החלקיקים הראשוני המתקבל על ידי TEM, מכיוון שככל ששני הערכים קרובים יותר, מידת האיסוף במדגם מתונה יותר.למעשה, ממוצע ה-Z של AgNP-I ו-AgNP-II גבוה באופן סביר מגודל החלקיקים העיקרי המוערך ב-TEM, ולכן בהשוואה ל-AgNP-III, דגימות אלו צפויות להיות בסבירות גבוהה יותר להצטבר, כאשר פוטנציאל הזטה השלילי ביותר מלווה בגודל קרוב הערך הממוצע Z.
ההסבר לתופעה זו יכול להיות כפול.מצד אחד, ריכוז הציטראט נשמר ברמה דומה בכל שלבי הסינתזה, ומספק כמות גבוהה יחסית של קבוצות משטח טעונות כדי למנוע משטח הפנים הספציפי של החלקיקים הגדלים לרדת.עם זאת, לפי Levak וחב', מולקולות קטנות כמו ציטראט ניתנות להחלפה בקלות על ידי ביומולקולות על פני החלקיקים.במקרה זה, היציבות הקולואידית תיקבע על ידי הקורונה של הביו-מולקולות המיוצרות.31 מכיוון שהתנהגות זו נצפתה גם במדידות הצבירה שלנו (על כך נדון בהרחבה בהמשך), מכסת ציטראט לבדה אינה יכולה להסביר תופעה זו.
מצד שני, גודל החלקיקים עומד ביחס הפוך לנטיית הצבירה ברמת הננומטר.הדבר נתמך בעיקר על ידי שיטת Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek המסורתית (DLVO), שבה משיכת חלקיקים מתוארת כסכום כוחות המשיכה והדחיה בין חלקיקים.לפי He וחב', הערך המקסימלי של עקומת האנרגיה DLVO יורד עם גודל הננו-חלקיקים בננו-חלקיקי ההמטיט, מה שמקל על הגעה למינימום האנרגיה הראשונית, ובכך מקדם צבירה בלתי הפיכה (עיבוי).47 עם זאת, משערים שישנם היבטים נוספים מעבר למגבלות התיאוריה של DLVO.למרות שכוח הכבידה של ואן דר וואלס ודחייה אלקטרוסטטית דו-שכבתית דומים עם הגדלת גודל החלקיקים, סקירה של Hotze et al.מציע שיש לה השפעה חזקה יותר על צבירה ממה ש-DLVO מאפשר.14 הם מאמינים שלא ניתן עוד להעריך את עקמומיות פני השטח של ננו-חלקיקים כמשטח שטוח, מה שהופך את האומדן המתמטי לבלתי ישים.בנוסף, ככל שגודל החלקיקים יורד, אחוז האטומים הנמצאים על פני השטח הופך גבוה יותר, מה שמוביל למבנה אלקטרוני ולהתנהגות מטען פני השטח.ותגובתיות פני השטח משתנה, מה שעלול להוביל לירידה במטען בשכבה הכפולה החשמלית ולקדם צבירה.
כאשר השוו את תוצאות ה-DLS של AgNP-I, AgNP-II ו-AgNP-III באיור 3, ראינו שכל שלוש הדגימות הראו הצטברות pH דומה.סביבה חומצית כבדה (pH 3) מסיטה את פוטנציאל הזטה של ​​הדגימה ל-0 mV, וגורמת לחלקיקים ליצור אגרגטים בגודל מיקרון, בעוד שה-pH אלקליין מעביר את פוטנציאל הזטה שלו לערך שלילי גדול יותר, כאשר החלקיקים יוצרים אגרגטים קטנים יותר (pH 5 ).ו-7.2) ), או להישאר לא מצטבר לחלוטין (pH 9).נצפו גם כמה הבדלים חשובים בין הדגימות השונות.במהלך הניסוי, AgNP-I הוכיח את עצמו כרגיש ביותר לשינויים בפוטנציאל הזטה המושרים ב-pH, מכיוון שפוטנציאל הזטה של ​​חלקיקים אלו הופחת ב-pH 7.2 בהשוואה ל-pH 9, בעוד ש-AgNP-II ו-AgNP-III הראו רק A שינוי ניכר ב-ζ הוא סביב pH 3. בנוסף, AgNP-II הראה שינויים איטיים יותר ופוטנציאל זיטה מתון, בעוד AgNP-III הראה את ההתנהגות הקלה ביותר מבין השלושה, מכיוון שהמערכת הראתה את ערך הזטה המוחלט הגבוה ביותר ותנועת מגמה איטית, מה שמצביע על כך. AgNP-III עמיד ביותר בפני צבירה הנגרמת על ידי pH.תוצאות אלו תואמות את תוצאות מדידת הקוטר ההידרודינמי הממוצע.בהתחשב בגודל החלקיקים של הפריימרים שלהם, AgNP-I הראה צבירה הדרגתית קבועה בכל ערכי ה-pH, ככל הנראה בשל הרקע של 10 mM NaCl, בעוד AgNP-II ו-AgNP-III הראו מובהקות רק ב-pH 3 של איסוף.ההבדל המעניין ביותר הוא שלמרות גודל הננו-חלקיק הגדול שלו, AgNP-III יוצר את האגרגטים הקטנים ביותר ב-pH 3 תוך 24 שעות, מה שמדגיש את תכונות האנטי-אגרגציה שלו.על ידי חלוקת ה-Z הממוצע של AgNPs ב-pH 3 לאחר 24 שעות בערך של המדגם המוכן, ניתן לראות שהגדלים המצטברים היחסיים של AgNP-I ו-AgNP-II גדלו פי 50, פי 42 ו-22. , בהתאמה.III.
איור 3 תוצאות פיזור האור הדינמי של מדגם ננו-חלקיקי כסף עם סיום ציטראט בגודל הולך וגדל (10 ננומטר: AgNP-I, 20 ננומטר: AgNP-II ו-50 ננומטר: AgNP-III) מתבטאות כקוטר ההידרודינמי הממוצע (ממוצע Z ) (ימין) בתנאי pH שונים, פוטנציאל הזטה (משמאל) משתנה תוך 24 שעות.
הצבירה התלויה ב-pH שנצפה השפיעה גם על תהודה פלסמונית משטחית (SPR) האופיינית של דגימות AgNP, כפי שמעידה על ידי ספקטרום ה-UV-Vis שלהן.לפי איור משלים S1, ההצטברות של כל שלושת מתלי הננו-חלקיקים מכסף מלווה בירידה בעוצמת שיאי ה-SPR שלהם והסטה אדומה מתונה.היקף השינויים הללו כפונקציה של ה-pH תואם את מידת הצבירה החזויה על ידי תוצאות DLS, עם זאת, כמה מגמות מעניינות נצפו.בניגוד לאינטואיציה, מסתבר שה-AgNP-II בגודל בינוני הוא הרגיש ביותר לשינויי SPR, בעוד ששתי הדגימות האחרות פחות רגישות.במחקר SPR, 50 ננומטר הוא מגבלת גודל החלקיקים התיאורטית, המשמשת להבחין בין חלקיקים על סמך התכונות הדיאלקטריות שלהם.ניתן לתאר חלקיקים קטנים מ-50 ננומטר (AgNP-I ו-AgNP-II) כדיפולים דיאלקטריים פשוטים, בעוד שלחלקיקים המגיעים או עולים על גבול זה (AgNP-III) יש תכונות דיאלקטריות מורכבות יותר, והתהודה שלהם הלהקה מתפצלת לשינויים מולטי-מודאליים .במקרה של שתי דגימות חלקיקים קטנות יותר, ניתן להתייחס ל-AgNP כדיפולים פשוטים, והפלזמה יכולה לחפוף בקלות.ככל שגודל החלקיקים גדל, צימוד זה מייצר למעשה פלזמה גדולה יותר, מה שעשוי להסביר את הרגישות הגבוהה יותר שנצפתה.29 עם זאת, עבור החלקיקים הגדולים ביותר, הערכת הדיפול הפשוטה אינה תקפה כאשר עלולים להתרחש גם מצבי צימוד אחרים, מה שיכול להסביר את הנטייה המופחתת של AgNP-III להצביע על שינויים ספקטרליים.29
בתנאי הניסוי שלנו, הוכח שלערך ה-pH יש השפעה עמוקה על היציבות הקולואידית של ננו-חלקיקי כסף מצופים בציטראט בגדלים שונים.במערכות אלה, יציבות מסופקת על ידי קבוצות -COO- הטעונות שלילי על פני השטח של AgNPs.הקבוצה הפונקציונלית הקרבוקסילטית של יון הציטראט פרוטונרית במספר רב של יוני H+, כך שקבוצת הקרבוקסיל שנוצרה אינה יכולה עוד לספק דחייה אלקטרוסטטית בין החלקיקים, כפי שמוצג בשורה העליונה של איור 4. על פי העיקרון של Le Chatelier, AgNP דגימות מתקבצות במהירות ב-pH 3, אך הופכות בהדרגה ליציבות יותר ויותר ככל שה-pH עולה.
איור 4 איור 4 מנגנון סכמטי של אינטראקציה פני השטח המוגדרת על ידי צבירה תחת pH שונה (שורה עליונה), ריכוז NaCl (שורה אמצעית), וביומולקולות (שורה תחתונה).
על פי איור 5, היציבות הקולואידית בתרחפי AgNP בגדלים שונים נבדקה גם בריכוזי מלח עולים.בהתבסס על פוטנציאל הזטה, גודל הננו-חלקיקים המוגדל במערכות AgNP עם סיום ציטראט מספק שוב עמידות מוגברת להשפעות חיצוניות של NaCl.ב-AgNP-I, 10 mM NaCl מספיקים כדי לגרום לצבירה קלה, וריכוז מלח של 50 mM מספק תוצאות דומות מאוד.ב-AgNP-II ו-AgNP-III, 10 mM NaCl לא משפיע באופן משמעותי על פוטנציאל הזטה מכיוון שהערכים שלהם נשארים ב-(AgNP-II) או מתחת ל-30 mV (AgNP-III).הגדלת ריכוז ה-NaCl ל-50 mM ולבסוף ל-150 mM NaCl מספיקה כדי להפחית משמעותית את הערך המוחלט של פוטנציאל הזטה בכל הדגימות, אם כי חלקיקים גדולים יותר שומרים על מטען שלילי יותר.תוצאות אלו תואמות את הקוטר ההידרודינמי הממוצע הצפוי של AgNPs;קווי המגמה הממוצעים של Z שנמדדו על 10, 50 ו-150 מ"מ NaCl מראים ערכים שונים הגדלים בהדרגה.לבסוף, אגרגטים בגודל מיקרון זוהו בכל שלושת הניסויים של 150 מ"מ.
איור 5 תוצאות פיזור האור הדינמי של מדגם ננו-חלקיקי כסף עם סיום ציטראט בגודל הולך וגדל (10 ננומטר: AgNP-I, 20 ננומטר: AgNP-II ו-50 ננומטר: AgNP-III) מתבטאות כקוטר ההידרודינמי הממוצע (ממוצע Z ) (ימין) ופוטנציאל זטה (משמאל) משתנים תוך 24 שעות בריכוזי NaCl שונים.
תוצאות UV-Vis באיור משלים S2 מראות כי ל-SPR של 50 ו-150 mM NaCl בכל שלוש הדגימות יש ירידה מיידית ומשמעותית.זה יכול להיות מוסבר על ידי DLS, כי צבירה מבוססת NaCl מתרחשת מהר יותר מאשר ניסויים תלויי pH, אשר מוסבר על ידי ההבדל הגדול בין המדידות המוקדמות (0, 1.5 ו-3 שעות).בנוסף, הגדלת ריכוז המלח תגביר גם את הפרתטיביות היחסית של המדיום הניסוי, שתהיה לה השפעה עמוקה על תהודה פלסמונית פני השטח.29
ההשפעה של NaCl מסוכמת בשורה האמצעית של איור 4. באופן כללי, ניתן להסיק שלהגדלת ריכוז הנתרן כלוריד יש השפעה דומה להעלאת החומציות, מכיוון שליוני Na+ יש נטייה לתאם סביב קבוצות הקרבוקסילטים, דיכוי AgNPs שלילי זיטה פוטנציאל.בנוסף, 150 mM NaCl ייצר אגרגטים בגודל מיקרון בכל שלוש הדגימות, מה שמצביע על כך שריכוז האלקטרוליטים הפיזיולוגי מזיק ליציבות הקולואידית של AgNPs עם סיום ציטראט.על ידי התחשבות בריכוז העיבוי הקריטי (CCC) של NaCl במערכות AgNP דומות, ניתן למקם תוצאות אלה בחוכמה בספרות הרלוונטית.Huynh et al.חישב שה-CCC של NaCl עבור ננו-חלקיקי כסף עם סיום ציטראט בקוטר ממוצע של 71 ננומטר היה 47.6 מ"מ, בעוד El Badawy et al.ראה שה-CCC של AgNPs 10 ננומטר עם ציפוי ציטראט היה 70 מ"מ.10,16 בנוסף, ה-CCC הגבוה באופן משמעותי של כ-300 mM נמדד על ידי He et al., מה שגרם לשיטת הסינתזה שלהם להיות שונה מהפרסום שהוזכר קודם לכן.48 למרות שהתרומה הנוכחית אינה מכוונת לניתוח מקיף של ערכים אלה, מכיוון שתנאי הניסוי שלנו גדלים במורכבות המחקר כולו, נראה שריכוז ה-NaCl הרלוונטי ביולוגית של 50 מ"מ, במיוחד 150 מ"מ NaCl, גבוה למדי.קרישה מושרה, מסביר את השינויים החזקים שזוהו.
השלב הבא בניסוי הפילמור הוא שימוש במולקולות פשוטות אך רלוונטיות מבחינה ביולוגית כדי לדמות אינטראקציות ננו-חלקיקים-ביומולקולות.בהתבסס על תוצאות DLS (איורים 6 ו-7) ו-UV-Vis (איורים משלימים S3 ו-S4), ניתן לקבוע כמה מסקנות כלליות.בתנאי הניסוי שלנו, המולקולות שנחקרו גלוקוז וגלוטמין לא יגרמו לצבירה באף מערכת AgNP, מכיוון שמגמת ה-Z-ממוצע קשורה קשר הדוק לערך מדידת הייחוס המקביל.למרות שנוכחותם אינה משפיעה על צבירה, תוצאות ניסוי מראות כי מולקולות אלו נספגות חלקית על פני השטח של AgNPs.התוצאה הבולטת התומכת בדעה זו היא השינוי הנצפה בספיגת האור.למרות ש-AgNP-I אינו מציג שינויים משמעותיים באורך גל או בעוצמה, ניתן לצפות בו בצורה ברורה יותר על ידי מדידת חלקיקים גדולים יותר, אשר ככל הנראה נובעת מהרגישות האופטית הגדולה יותר שהוזכרה קודם לכן.ללא קשר לריכוז, גלוקוז יכול לגרום לשינוי אדום גדול יותר לאחר 1.5 שעות בהשוואה למדידת הביקורת, שהיא כ-40 ננומטר ב-AgNP-II וכ-10 ננומטר ב-AgNP-III, מה שמוכיח את התרחשותם של אינטראקציות פני השטח.גלוטמין הראה מגמה דומה, אבל השינוי לא היה כל כך ברור.בנוסף, ראוי גם להזכיר שגלוטמין יכול להפחית את פוטנציאל הזטה המוחלט של חלקיקים בינוניים וגדולים.עם זאת, מכיוון ששינויי הזטה הללו אינם משפיעים על רמת הצבירה, ניתן לשער שאפילו ביומולקולות קטנות כמו גלוטמין יכולות לספק מידה מסוימת של דחייה מרחבית בין חלקיקים.
איור 6 תוצאות פיזור האור הדינמי של דגימות ננו-חלקיקי כסף עם סיום ציטראט בגודל הולך וגדל (10 ננומטר: AgNP-I, 20 ננומטר: AgNP-II ו-50 ננומטר: AgNP-III) מתבטאות כקוטר ההידרודינמי הממוצע (ממוצע Z) (מימין) בתנאים חיצוניים של ריכוזי גלוקוז שונים, פוטנציאל הזטה (משמאל) משתנה תוך 24 שעות.
איור 7 תוצאות פיזור האור הדינמי של דגימת ננו-חלקיקי כסף עם סיום ציטראט בגודל הולך וגדל (10 ננומטר: AgNP-I, 20 ננומטר: AgNP-II ו-50 ננומטר: AgNP-III) מבוטאות כקוטר ההידרודינמי הממוצע (ממוצע Z ) (ימין) בנוכחות גלוטמין, פוטנציאל הזטה (משמאל) משתנה תוך 24 שעות.
בקיצור, ביומולקולות קטנות כמו גלוקוז וגלוטמין אינן משפיעות על יציבות קולואידית בריכוז הנמדד: למרות שהן משפיעות על פוטנציאל הזטה ותוצאות UV-Vis בדרגות שונות, התוצאות הממוצעות של Z אינן עקביות.זה מצביע על כך שספיחת פני השטח של מולקולות מעכבת דחייה אלקטרוסטטית, אך בו זמנית מספקת יציבות מימדית.
על מנת לקשר את התוצאות הקודמות עם התוצאות הקודמות ולדמות תנאים ביולוגיים בצורה מיומנת יותר, בחרנו כמה ממרכיבי תרבית התאים הנפוצים ביותר והשתמשנו בהם כתנאים ניסיוניים לחקר היציבות של קולואידים AgNP.בניסוי במבחנה כולו, אחד התפקידים החשובים ביותר של DMEM כמדיום הוא לבסס את התנאים האוסמוטיים הדרושים, אך מנקודת מבט כימית, מדובר בתמיסת מלח מורכבת עם חוזק יוני הכולל דומה ל-150 mM NaCl .40 באשר ל-FBS, זוהי תערובת מורכבת של ביו-מולקולות - בעיקר חלבונים - מנקודת מבט של ספיחה פני השטח, יש לה קווי דמיון עם תוצאות הניסוי של גלוקוז וגלוטמין, למרות ההרכב הכימי והמגוון המין הוא הרבה יותר מסובך.19 DLS ו-UV-התוצאות הנראות לעין המוצגות באיור 8 ובאיור המשלים S5, בהתאמה, יכולות להיות מוסברות על ידי בחינת ההרכב הכימי של חומרים אלה ומתאם אותם עם המדידות בסעיף הקודם.
איור 8 תוצאות פיזור האור הדינמי של מדגם ננו-חלקיקי כסף עם סיום ציטראט בגודל הולך וגדל (10 ננומטר: AgNP-I, 20 ננומטר: AgNP-II ו-50 ננומטר: AgNP-III) מתבטאות כקוטר ההידרודינמי הממוצע (ממוצע Z ) (ימין) בנוכחות רכיבי תרבית תאים DMEM ו-FBS, פוטנציאל הזטה (משמאל) משתנה תוך 24 שעות.
לדילול של AgNPs בגדלים שונים ב-DMEM יש השפעה דומה על היציבות הקולואידית לזו שנצפתה בנוכחות ריכוזי NaCl גבוהים.הפיזור של AgNP ב-50 v/v% DMEM הראה שצבירה בקנה מידה גדול זוהה עם עליית פוטנציאל הזטה והערך הממוצע Z והירידה החדה של עוצמת SPR.ראוי לציין כי הגודל המצטבר המרבי המושרה על ידי DMEM לאחר 24 שעות עומד ביחס הפוך לגודל של ננו-חלקיקי פריימר.
האינטראקציה בין FBS ל-AgNP דומה לזו שנצפתה בנוכחות מולקולות קטנות יותר כגון גלוקוז וגלוטמין, אך ההשפעה חזקה יותר.ממוצע ה-Z של החלקיקים לא מושפע, בעוד שמתגלה עלייה בפוטנציאל הזטה.שיא ה-SPR הראה שינוי אדום קל, אבל אולי יותר מעניין, עוצמת ה-SPR לא ירדה בצורה משמעותית כמו במדידת הביקורת.ניתן להסביר את התוצאות הללו על ידי ספיחה מולדת של מקרומולקולות על פני השטח של ננו-חלקיקים (השורה התחתונה באיור 4), שכעת מובנת כהיווצרות קורונה ביו-מולקולרית בגוף.49