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ナノ粒子は小さいほど常に優れているのでしょうか?生物学的に関連した条件下での銀ナノ粒子のサイズ依存性凝集の生物学的影響を理解する
著者: Bélteky P、Rónavári A、Zakupszky D、Boka E、Igaz N、Szerencsés B、Pfeiffer I、Vágvölgyi C、Kiricsi M、Kónya Z
Péter Bélteky,1,* Andrea Rónavári,1,* Dalma Zakupszky,1 Eszter Boka,1 Nóra Igaz,2 Bettina Szerencsés,3 Ilona Pfeiffer,3 Csaba Vágvölgyi,3 Mónika Kiricsi (環境化学、ハンガリー、ハンガリー) 科学情報学部、セゲド大学。2 ハンガリーのセゲド大学科学情報学部生化学および分子生物学科。3 ハンガリーのセゲド大学科学情報学部微生物学科。4MTA-SZTE 反応速度論および表面化学研究グループ、ハンガリー、セゲド* これらの著者は、この研究に等しく貢献しました。連絡先: Zoltán Kónya 応用環境化学学部、科学情報学部、セゲド大学、Rerrich Square 1、Szeged、H-6720、Hungary 電話 +36 62 544620 電子メール [電子メール保護] 目的: 銀ナノ粒子 (AgNP) は、特に生物医学への応用により、最も一般的に研究されているナノマテリアルの 1 つです。しかし、ナノ粒子の凝集により、その優れた細胞毒性と抗菌活性は生物学的媒体中では損なわれることがよくあります。この研究では、平均直径 10、20、および 50 nm の 3 つの異なるクエン酸末端銀ナノ粒子サンプルの凝集挙動と関連する生物活性が研究されました。方法: 透過型電子顕微鏡を使用してナノ粒子を合成および特性評価し、動的光散乱および紫外可視分光法によってさまざまな pH 値、NaCl、グルコースおよびグルタミン濃度での凝集挙動を評価します。さらに、細胞培養培地では、ダルベッコなどの成分がイーグル培地や子牛胎児血清の凝集挙動を改善します。結果: 結果は、酸性 pH と生理的電解質含有量が一般にミクロンスケールの凝集を誘発し、これが生体分子コロナの形成によって媒介される可能性があることを示しています。大きな粒子は、小さな粒子よりも外部の影響に対して高い耐性を示すことは注目に値します。インビトロの細胞毒性および抗菌性試験は、さまざまな凝集段階でナノ粒子凝集体で細胞を処理することによって実行されました。結論: 極端な凝集は生物学的活性の完全な喪失につながるため、我々の結果は、コロイドの安定性と AgNP の毒性との間に深い相関関係があることを明らかにしました。より大きな粒子で観察されるより高い程度の抗凝集は、そのようなサンプルがより多くの抗菌活性と哺乳類細胞活性を保持するため、in vitro 毒性に重大な影響を及ぼします。これらの発見は、関連文献における一般的な意見にもかかわらず、可能な限り小さなナノ粒子をターゲットにすることが最善の行動ではない可能性があるという結論につながります。キーワード: 種子媒介増殖、コロイド安定性、サイズ依存性凝集挙動、凝集損傷毒性
ナノマテリアルの需要と生産量が増加し続けるにつれて、ナノマテリアルの生物学的安全性や生物学的活性にますます注目が集まっています。銀ナノ粒子 (AgNP) は、その優れた触媒特性、光学特性、生物学的特性により、このクラスの材料の代表として最も一般的に合成、研究、利用されているものの 1 つです。1 一般に、ナノマテリアル (AgNP を含む) の独特な特性は、主にその大きな比表面積に起因すると考えられています。したがって、必然的に問題となるのは、粒子サイズ、表面コーティング、凝集など、この重要な機能に影響を与えるプロセスであり、特定の用途にとって重要なナノ粒子の特性に重大な損傷を与えるかどうかです。
粒子サイズと安定剤の影響は、文献で比較的よく文書化されている主題です。例えば、一般に受け入れられている見解は、小さなナノ粒子は大きなナノ粒子よりも毒性が高いということです。2 一般的な文献と一致して、我々のこれまでの研究では、哺乳動物の細胞および微生物に対するナノ銀のサイズ依存性の活性が実証されています。3–5 表面コーティングは、ナノマテリアルの特性に広範な影響を与えるもう 1 つの属性です。表面に安定剤を追加または修飾するだけで、同じナノ材料でもまったく異なる物理的、化学的、生物学的特性を持つ可能性があります。キャッピング剤の適用は、ナノ粒子合成の一部として実行されることがほとんどです。たとえば、クエン酸末端銀ナノ粒子は、この研究で最も関連性の高い AgNP の 1 つであり、反応媒体として選択された安定剤溶液中で銀塩を還元することによって合成されます。クエン酸塩は、その低コスト、入手可能性、生体適合性、および銀に対する強い親和性を容易に活用でき、これは可逆的な表面吸着からイオン相互作用まで、提案されているさまざまな相互作用に反映されます。クエン酸塩、ポリマー、高分子電解質、生物剤などの小分子や 7,8 付近の多原子イオンも、ナノ銀を安定化し、ナノ銀に独自の官能化を施すために一般的に使用されます。9-12
意図的な表面キャッピングによってナノ粒子の活性を変える可能性は非常に興味深い分野ですが、この表面コーティングの主な役割は無視でき、ナノ粒子システムにコロイド安定性をもたらします。ナノマテリアルの大きな比表面積は大きな表面エネルギーを生成し、システムの熱力学的能力が最小エネルギーに到達するのを妨げます。13 適切な安定化がないと、ナノマテリアルの凝集が生じる可能性があります。凝集とは、分散した粒子が出会い、現在の熱力学的相互作用によって粒子が互いに付着するときに発生する、さまざまな形状やサイズの粒子の凝集体の形成です。したがって、安定剤は、熱力学的引力に対抗するために粒子間に十分に大きな反発力を導入することによって凝集を防ぐために使用されます。14
粒子サイズと表面被覆率の主題は、ナノ粒子によって引き起こされる生物活性の制御という文脈で徹底的に研究されてきましたが、粒子の凝集はほとんど無視されている領域です。生物学的に関連した条件下でのナノ粒子のコロイド安定性を解決するための徹底的な研究はほとんどありません。10,15-17 さらに、この寄与は特にまれであり、凝集に関連する毒性も研究されており、たとえそれが血管血栓症などの有害反応、またはその毒性などの望ましい特性の喪失を引き起こす可能性があるとしても、図 1.18、19 に示します。実際、銀ナノ粒子耐性の既知の数少ないメカニズムの 1 つは凝集に関連しています。これは、特定の大腸菌および緑膿菌株が、フラジェリンタンパク質であるフラジェリンを発現することによってナノ銀感受性を低下させることが報告されているためです。銀との親和性が高く、凝集を誘発します。20
銀ナノ粒子の毒性にはいくつかの異なるメカニズムがあり、凝集はこれらすべてのメカニズムに影響を与えます。AgNP の生物学的活性について最も議論されている方法は、「トロイの木馬」機構とも呼ばれ、AgNP を Ag+ キャリアとみなします。1,21 トロイの木馬のメカニズムにより、局所的な Ag+ 濃度が確実に大幅に増加し、ROS の生成と膜の脱分極が引き起こされます。22-24 凝集は、銀イオンが酸化して溶解する可能性のある有効活性表面を減少させるため、Ag+ の放出に影響を及ぼし、それによって毒性に影響を与える可能性があります。ただし、AgNP はイオン放出によって毒性を示すだけではありません。サイズと形態に関連する多くの相互作用を考慮する必要があります。中でも、ナノ粒子表面のサイズと形状が決定的な特徴です。4,25 これらのメカニズムの集合は、「誘発毒性メカニズム」として分類できます。細胞小器官に損傷を与え、細胞死を引き起こす可能性のあるミトコンドリアおよび表面膜の反応が潜在的に多数存在します。25-27 凝集体の形成は、生体システムによって認識される銀含有物体のサイズと形状に自然に影響を与えるため、これらの相互作用も影響を受ける可能性があります。
銀ナノ粒子の凝集に関する以前の論文では、この問題を研究するための化学実験とインビトロ生物学実験からなる効果的なスクリーニング手順を実証しました。19 動的光散乱 (DLS) は、材料がその粒子のサイズに匹敵する波長で光子を散乱できるため、この種の検査には推奨される技術です。液体媒体中の粒子のブラウン運動速度はサイズに関連しているため、散乱光の強度の変化を使用して液体サンプルの平均流体力学直径 (Z 平均) を決定できます。また、試料に電圧を印加することにより、Z 平均値と同様にナノ粒子のゼータ電位 (ζ 電位) を測定することができます。13,28 ゼータ電位の絶対値が十分に高い場合 (一般ガイドラインによると > ±30 mV)、粒子間に強い静電反発力が発生し、凝集に対抗します。特徴的な表面プラズモン共鳴 (SPR) は、主に貴金属ナノ粒子 (主に Au と Ag) に起因する独特の光学現象です。29 ナノスケールでのこれらの材料の電子振動 (表面プラズモン) に基づいて、球状 AgNP は 400 nm 付近に特徴的な UV-Vis 吸収ピークを持つことが知られています。30 この方法はナノ粒子の凝集や生体分子の表面吸着の検出に使用できるため、粒子の強度と波長シフトは DLS の結果を補足するために使用されます。
得られた情報に基づいて、AgNP 毒性を (最も一般的に使用される因子) ナノ粒子濃度ではなく凝集レベルの関数として記述する方法で、細胞生存率 (MTT) および抗菌アッセイが実行されます。たとえば、クエン酸末端 AgNP は凝集により数時間以内に生物学的活性を完全に失うため、このユニークな方法により、生物学的活性における凝集レベルの重要性を実証することができます。19
現在の研究では、ナノ粒子の凝集に対するナノ粒子サイズの影響を研究することにより、生体関連コロイドの安定性と生物活性に対するコロイドの影響に関するこれまでの貢献を大幅に拡大することを目指しています。これは間違いなくナノ粒子の研究の一つです。この問題を調査するために、シード媒介成長法を使用して、3 つの異なるサイズ範囲 (10、20、および 50 nm) のクエン酸末端 AgNP を生成しました。最も一般的な方法の 1 つとして 6,32 が挙げられます。医療用途で広く日常的に使用されているナノ材料については、ナノ銀の凝集に関連する生物学的特性のサイズ依存性を研究するために、さまざまなサイズのクエン酸末端 AgNP が選択されます。さまざまなサイズの AgNP を合成した後、透過型電子顕微鏡 (TEM) によって生成されたサンプルの特性を評価し、前述のスクリーニング手順を使用して粒子を検査しました。さらに、in vitro 細胞培養ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) およびウシ胎児血清 (FBS) の存在下で、サイズ依存の凝集挙動とその挙動をさまざまな pH 値、NaCl、グルコース、グルタミン濃度で評価しました。細胞毒性の特性は総合的な条件の下で決定されます。科学的なコンセンサスは、一般に粒子が小さい方が好ましいことを示しています。私たちの調査は、これが事実であるかどうかを判断するための化学的および生物学的プラットフォームを提供します。
異なるサイズ範囲を持つ 3 つの銀ナノ粒子を、Wan らによって提案されたシード媒介成長法にわずかな調整を加えて調製しました。6 この方法は、銀源として硝酸銀 (AgNO3)、還元剤として水素化ホウ素ナトリウム (NaBH4)、安定剤としてクエン酸ナトリウムを使用する化学還元に基づいています。まず、クエン酸ナトリウム二水和物（Na3C6H5O7×2H2O）から9mMクエン酸水溶液75mLを調製し、70℃に加熱します。次いで、２ｍＬの１％ｗ／ｖＡｇＮＯ３溶液を反応媒体に添加し、次いで新たに調製した水素化ホウ素ナトリウム溶液（２ｍＬ、０．１％ｗ／ｖ）を混合物に滴下した。得られた黄褐色の懸濁液を、激しく撹拌しながら７０℃で１時間保持し、その後、室温まで冷却した。得られたサンプル (以降、AgNP-I と呼びます) は、次の合成ステップでシード媒介増殖の基礎として使用されます。
中サイズの粒子懸濁液 (AgNP-II と表記) を合成するには、90 mL の 7.6 mM クエン酸溶液を 80°C に加熱し、10 mL の AgNP-I と混合し、次に 2 mL の 1% w/v AgNO3 溶液を混合します。激しく機械的に撹拌しながら１時間保持し、その後、サンプルを室温まで冷却した。
最大の粒子 (AgNP-III) については、同じ成長プロセスを繰り返しますが、この場合、シード懸濁液として 10 mL の AgNP-II を使用します。サンプルが室温に達した後、追加の溶媒を 40℃ で添加または蒸発させることにより、総 AgNO3 含有量に基づく公称 Ag 濃度を 150 ppm に設定し、最終的に使用するまで 4℃ で保管します。
FEI Tecnai G2 20 X-Twin 透過電子顕微鏡 (TEM) (FEI 本社、米国オレゴン州ヒルズボロ) を加速電圧 200 kV で使用して、ナノ粒子の形態学的特性を調べ、電子回折 (ED) パターンをキャプチャします。少なくとも 15 枚の代表的な画像 (約 750 個の粒子) が ImageJ ソフトウェア パッケージを使用して評価され、結果のヒストグラム (および研究全体のすべてのグラフ) が OriginPro 2018 (OriginLab、米国マサチューセッツ州ノーサンプトン) で作成されました 33, 34。
サンプルの平均流体力学直径 (Z 平均)、ゼータ電位 (ゼータ電位)、および特性表面プラズモン共鳴 (SPR) を測定して、初期コロイド特性を示しました。サンプルの平均流体力学直径およびゼータ電位は、使い捨ての折り畳みキャピラリーセルを使用して、Malvern Zetasizer Nano ZS 機器 (Malvern Instruments、Malvern、UK) によって 37±0.1℃で測定されました。Ocean Optics 355 DH-2000-BAL UV-Vis 分光光度計 (Halma PLC、米国フロリダ州ラルゴ) を使用して、250 ～ 800 nm の範囲のサンプルの UV-Vis 吸収スペクトルから特徴的な SPR 特性を取得しました。
実験全体を通じて、コロイドの安定性に関連する 3 つの異なる測定タイプが同時に実行されました。DLS を使用して粒子の平均流体力学的直径 (Z 平均) とゼータ電位 (ζ 電位) を測定します。これは、Z 平均はナノ粒子凝集体の平均サイズに関連しており、ゼータ電位は系内の静電反発力が大きいかどうかを示すためです。ナノ粒子間のファンデルワールス引力を相殺するのに十分なほど強力です。測定は 3 回行い、Z 平均とゼータ電位の標準偏差は Zetasizer ソフトウェアによって計算されます。ピーク強度と波長の変化は凝集と表面相互作用を示す可能性があるため、粒子の特徴的な SPR スペクトルは UV-Vis 分光法によって評価されます。29,35 実際、貴金属の表面プラズモン共鳴は生体分子の新しい分析方法につながるほど大きな影響力を持っています。29、36、37 実験混合物中の AgNP の濃度は約 10 ppm で、目的は最大初期 SPR 吸収の強度を 1 に設定することです。実験は 0 で時間依存的に実行されました。1.5;3;6;生物学的に関連するさまざまな条件下で 12 時間および 24 時間。実験の詳細については、以前の研究で説明しています。19 つまり、さまざまな pH 値 (3; 5; 7.2 および 9)、さまざまな塩化ナトリウム (10 mM; 50 mM; 150 mM)、グルコース (3.9 mM; 6.7 mM) およびグルタミン (4 mM) 濃度、およびまた、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）とウシ胎児血清（FBS）（水およびDMEM中）をモデル系として調製し、合成された銀ナノ粒子の凝集挙動に対するそれらの影響を研究しました。pH、NaCl、グルコース、グルタミンの値は生理学的濃度に基づいて評価されますが、DMEMとFBSの量はin vitro実験全体で使用されるレベルと同じです。38-42 すべての測定は、長距離の粒子相互作用を排除するために、10 mM NaCl の一定のバックグラウンド塩濃度を使用して、pH 7.2 および 37°C で実行されました (特定の pH および NaCl 関連の実験を除き、これらの属性は以下の変数です)。勉強）。さまざまな条件のリストを表 1 にまとめます。† でマークされた実験は参照として使用され、10 mM NaCl および pH 7.2 を含むサンプルに対応します。
ヒト前立腺がん細胞株 (DU145) および不死化ヒトケラチノサイト (HaCaT) は、ATCC (米国バージニア州マナッサス) から入手しました。細胞は、10% FBS、2 mM L-グルタミン、0.01 % ストレプトマイシンおよび 0.005% を補充した、4.5 g/L グルコースを含むダルベッコ最小必須培地イーグル (DMEM) (Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス) で日常的に培養します。ペニシリン（米国ミズーリ州セントルイスのシグマ・アルドリッチ）。細胞は、5% CO2、湿度 95% の 37°C インキュベーター内で培養されます。
時間依存的な粒子凝集によって引き起こされる AgNP 細胞毒性の変化を調べるために、2 段階の MTT アッセイを実行しました。まず、AgNP-I、AgNP-II、および AgNP-III で処理した後、2 つの細胞型の生存率を測定しました。この目的を達成するために、2 種類の細胞を 10,000 細胞/ウェルの密度で 96 ウェル プレートに播種し、2 日目に濃度を増加させた 3 つの異なるサイズの銀ナノ粒子で処理しました。２４時間の処理後、細胞をＰＢＳで洗浄し、培地で希釈した０．５ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴ試薬（ＳＥＲＶＡ、ハイデルベルク、ドイツ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。ホルマザン結晶を DMSO (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) に溶解し、Synergy HTX プレートリーダー (BioTek-Hungary、ブダペスト、ハンガリー) を使用して 570 nm で吸光度を測定しました。未処理の対照サンプルの吸収値は 100% の生存率と見なされます。4 つの独立した生物学的複製を使用して、少なくとも 3 つの実験を実行します。IC50 は、活力の結果に基づいた用量反応曲線から計算されます。
その後、第 2 段階で、細胞処理前に粒子を 150 mM NaCl と異なる時間 (0、1.5、3、6、12、および 24 時間) 培養することにより、銀ナノ粒子の異なる凝集状態が生成されました。続いて、粒子凝集によって影響を受ける細胞生存率の変化を評価するために、前述と同じ MTT アッセイを実行しました。GraphPad Prism 7 を使用して最終結果を評価し、対応のない t 検定によって実験の統計的有意性を計算し、そのレベルを * (p ≤ 0.05)、** (p ≤ 0.01)、*** (p ≤ 0.001) としてマークします。 ) および **** (p ≤ 0.0001)。
クリプトコッカス・ネオフォルマンス IFM 5844 (IFM; 千葉大学病原菌・微生物毒性研究センター) およびバチルス・テスト・メガテリウム SZMC 6031 に対する抗菌感受性には、3 つの異なるサイズの銀ナノ粒子 (AgNP-I、AgNP-II、および AgNP-III) が使用されました。 (SZMC: Szeged Microbiology Collection) およびRPMI 1640 培地中の大腸菌 SZMC 0582 (Sigma-Aldrich Co.)。粒子の凝集によって引き起こされる抗菌活性の変化を評価するために、まず、96 ウェル マイクロタイター プレートでの微量希釈によって粒子の最小発育阻止濃度 (MIC) を測定しました。標準化細胞懸濁液 (RPMI 1640 培地で 5 × 104 細胞/mL) 50 μL に銀ナノ粒子懸濁液 50 μL を加え、濃度を 2 倍に連続希釈します (前述の培地では、範囲は 0 ～ 75 ppm、つまり、対照サンプルには、50 μL の細胞懸濁液と、ナノ粒子を含まない 50 μL の培地が含まれています。その後、プレートを30℃で48時間インキュベートし、SPECTROstar Nanoプレートリーダー(BMG LabTech、Offenburg、Germany)を使用して培養物の光学密度を620 nmで測定した。実験は三重反復で３回行われた。
この時点で50μLの単一凝集ナノ粒子サンプルを使用したことを除いて、前述と同じ手順を使用して、前述の株の抗菌活性に対する凝集の影響を調べました。銀ナノ粒子の異なる凝集状態は、細胞処理前に粒子を150 mM NaClとともに異なる時間（0、1.5、3、6、12、および24時間）インキュベートすることによって生成されます。50μLのRPMI 1640培地を補充した懸濁液を増殖対照として使用し、一方、毒性を制御するために、非凝集ナノ粒子を含む懸濁液を使用した。実験は三重反復で３回行われた。GraphPad Prism 7 を使用して、MTT 分析と同じ統計分析を使用して最終結果を再度評価します。
最小粒子 (AgNP-I) の凝集レベルは特徴づけられており、その結果は以前の研究で部分的に公開されましたが、より適切に比較するために、すべての粒子が徹底的にスクリーニングされました。実験データは収集され、次のセクションで説明されます。AgNP の 3 つのサイズ。19
TEM、UV-Vis、および DLS によって実行された測定により、すべての AgNP サンプルの合成が成功したことが確認されました (図 2A ～ D)。図 2 の最初の行によれば、最小の粒子 (AgNP-I) は、平均直径が約 10 nm の均一な球形の形態を示しています。シード媒介成長法では、平均粒径がそれぞれ約 20 nm および 50 nm の異なるサイズ範囲の AgNP-II および AgNP-III も提供されます。粒子分布の標準偏差によれば、3 つのサンプルのサイズは重なりません。これは比較分析に重要です。TEM ベースの粒子 2D 投影の平均アスペクト比と薄さ比を比較することにより、粒子の真球度が ImageJ の形状フィルター プラグインによって評価されると想定されます (図 2E)。43 粒子の形状の分析によると、粒子のアスペクト比（最小外接長方形の長辺/短辺）は粒子の成長に影響されず、厚さの比（対応する真円の測定面積/理論面積）は影響を受けません。 ）徐々に減少していきます。これにより、薄さの比 1 に相当する、理論的には完全に円形の多面体粒子がさらに多くなります。
図 2 透過型電子顕微鏡 (TEM) 画像 (A)、電子回折 (ED) パターン (B)、サイズ分布ヒストグラム (C)、特徴的な紫外可視 (UV-Vis) 光吸収スペクトル (D)、および平均液体クエン酸塩機械直径 (Z 平均)、ゼータ電位、アスペクト比、および厚さ比 (E) を備えた末端処理銀ナノ粒子には 3 つの異なるサイズ範囲があります: AgNP-I は 10 nm (上の列)、AgNP -II は 20 nm (中央の列) )、AgNP-III (下段) は 50 nm。
成長法の周期的な性質が粒子形状にある程度影響を及ぼし、その結果、より大きな AgNP の球形度が小さくなりましたが、3 つのサンプルはすべて準球形のままでした。さらに、図２Ｂの電子回折パターンに示されるように、ナノ粒子の結晶化度は影響を受けない。銀のミラー指数 (111)、(220)、(200)、および (311) と相関することができる顕著な回折リングは、科学文献および我々のこれまでの貢献と非常に一致しています。9、19、44 AgNP-II および AgNP-III のデバイ シェラー リングの断片化は、ED 画像が同じ倍率で撮影されるため、粒子サイズが大きくなるにつれて 1 個当たりの回折粒子の数が増加することが原因です。単位面積が増減します。
ナノ粒子のサイズと形状は生物活性に影響を与えることが知られています。3,45 形状に依存する触媒活性や生物活性は、形状が異なると特定の結晶面 (ミラー指数が異なる) が増殖する傾向があり、これらの結晶面が異なる活性を持つという事実によって説明できます。調製された粒子は、非常に類似した結晶特性に対応する同様の ED 結果を提供するため、その後のコロイド安定性と生物活性の実験では、観察された差異は形状関連の特性ではなく、ナノ粒子のサイズに起因すると考えられます。
図 2D にまとめた UV-Vis の結果は、3 つのサンプルすべての SPR ピークが球状銀ナノ粒子の特性値である約 400 nm にあるため、合成された AgNP の圧倒的な球状の性質をさらに強調しています。29,30 捕捉されたスペクトルにより、ナノ銀のシード媒介成長が成功したことも確認されました。粒子サイズが増加するにつれて、AgNP-II の最大光吸収に対応する波長がより顕著になります。文献によると、AgNP-III は赤方偏移を経験しました。6,29
AgNP システムの初期コロイド安定性に関しては、DLS を使用して、pH 7.2 で粒子の平均流体力学的直径とゼータ電位を測定しました。図 2E に示す結果は、AgNP-III が AgNP-I または AgNP-II よりもコロイド安定性が高いことを示しています。これは、一般的なガイドラインでは、長期コロイド安定性には絶対 30 mV のゼータ電位が必要であることが示されているためです。この発見は、次の場合にさらに裏付けられます。 Z 平均値 (遊離粒子と凝集粒子の平均流体力学的直径として取得) を TEM で取得した一次粒子径と比較します。これは、2 つの値が近ければ近いほど、サンプル内の凝集の度合いが緩やかになるためです。実際、AgNP-I および AgNP-II の Z 平均は、主な TEM 評価粒子サイズよりもかなり高いため、AgNP-III と比較して、これらのサンプルは凝集する可能性が高いと予測されます。 Z の平均値に近いサイズを伴います。
この現象の説明は 2 つあります。一方で、クエン酸濃度はすべての合成ステップで同様のレベルに維持され、比較的多量の帯電表面基を提供して、成長する粒子の比表面積の減少を防ぎます。しかし、Levakらによると、クエン酸塩のような小分子は、ナノ粒子の表面上の生体分子によって容易に交換される可能性がある。この場合、コロイドの安定性は、生成される生体分子のコロナによって決まります。この挙動は凝集測定でも観察されたため (後で詳しく説明します)、クエン酸塩キャッピングだけではこの現象を説明できません。
一方、粒子径はナノメートルレベルの凝集傾向に反比例します。これは主に従来の Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO) 法によって裏付けられており、粒子の引力は粒子間の引力と斥力の合計として記述されます。Heらによると、DLVOエネルギー曲線の最大値はヘマタイトナノ粒子のナノ粒子のサイズとともに減少し、最小一次エネルギーに到達しやすくなり、それによって不可逆的な凝集（凝縮）が促進されるという。47 ただし、DLVO 理論の限界を超える別の側面があると推測されます。ファンデルワールス重力と静電二重層反発力は粒子サイズが大きくなっても同様ですが、Hotze et al. のレビューでは、DLVO が許可するよりも集約に対して強力な効果があると提案しています。[14] 彼らは、ナノ粒子の表面曲率はもはや平面として推定できず、数学的推定が適用できないと考えています。さらに、粒子サイズが小さくなるにつれて、表面に存在する原子の割合が高くなり、電子構造と表面電荷の挙動が生じます。また、表面の反応性が変化し、電気二重層の電荷が減少し、凝集が促進される可能性があります。
図 3 の AgNP-I、AgNP-II、および AgNP-III の DLS 結果を比較すると、3 つのサンプルすべてが凝集を促進する同様の pH を示したことが観察されました。強酸性環境 (pH 3) では、サンプルのゼータ電位が 0 mV にシフトし、粒子がミクロンサイズの凝集体を形成します。一方、アルカリ性 pH では、ゼータ電位がより大きな負の値にシフトし、粒子はより小さな凝集体を形成します (pH 5)。 ）。および 7.2) )、または完全に凝集しないままになります (pH 9)。異なるサンプル間でいくつかの重要な違いも観察されました。実験全体を通じて、AgNP-I は、pH 誘発ゼータ電位変化に対して最も敏感であることが証明されました。これは、これらの粒子のゼータ電位が pH 9 と比較して pH 7.2 で低下しているのに対し、AgNP-II および AgNP-III は A のみを示したためです。ゼータの大きな変化は pH 3 付近です。さらに、AgNP-II はより遅い変化と中程度のゼータ電位を示しましたが、AgNP-III は 3 つの中で最も穏やかな挙動を示しました。これは、システムが最も高い絶対ゼータ値とゆっくりとした傾向の動きを示したためであり、 AgNP-III pH による凝集に対して最も耐性があります。これらの結果は、平均流体力学的直径の測定結果と一致しています。プライマーの粒子サイズを考慮すると、AgNP-I はすべての pH 値で一定の段階的な凝集を示しましたが、これはおそらく 10 mM NaCl バックグラウンドによるものですが、AgNP-II および AgNP-III は pH 3 でのみ顕著な凝集を示しました。最も興味深い違いは、AgNP-III はナノ粒子サイズが大きいにもかかわらず、pH 3 で 24 時間以内に最小の凝集体を形成し、その抗凝集特性が強調されることです。24 時間後の pH 3 での AgNP の平均 Z を調製したサンプルの値で割ることにより、AgNP-I および AgNP-II の相対凝集体サイズが 50 倍、42 倍、および 22 倍増加したことが観察できます。 、 それぞれ。Ⅲ．
図 3 サイズを増加させたクエン酸末端銀ナノ粒子サンプル (10 nm: AgNP-I、20 nm: AgNP-II、50 nm: AgNP-III) の動的光散乱の結果は、平均流体力学的直径 (Z 平均) として表されます。 ) (右) 異なる pH 条件下では、ゼータ電位 (左) は 24 時間以内に変化します。
観察された pH 依存性の凝集は、UV-Vis スペクトルによって証明されるように、AgNP サンプルの特徴的な表面プラズモン共鳴 (SPR) にも影響を与えました。補足図 S1 によると、3 つすべての銀ナノ粒子懸濁液の凝集の後に、SPR ピークの強度の低下と中程度の赤方偏移が続きます。pH の関数としてのこれらの変化の程度は、DLS 結果によって予測される凝集の程度と一致していますが、いくつかの興味深い傾向が観察されています。直感に反して、中型の AgNP-II が SPR 変化に対して最も敏感であり、他の 2 つのサンプルはそれほど敏感ではないことがわかります。SPR 研究では、50 nm が理論上の粒子サイズの限界であり、誘電特性に基づいて粒子を区別するために使用されます。50 nm より小さい粒子 (AgNP-I および AgNP-II) は単純な誘電双極子として説明できますが、この限界に達するかそれを超える粒子 (AgNP-III) はより複雑な誘電特性とその共鳴を持ちます。バンドは多峰性の変化に分割されます。 。2 つの小さな粒子サンプルの場合、AgNP は単純な双極子と見なすことができ、プラズマは簡単に重なり合う可能性があります。粒子サイズが増加すると、このカップリングにより本質的により大きなプラズマが生成され、これが観察される感度の高さを説明する可能性があります。ただし、最大の粒子の場合、他の結合状態も発生する可能性がある場合、単純な双極子の推定は有効ではありません。これは、AgNP-III のスペクトル変化を示す傾向の減少を説明できます。29
私たちの実験条件下では、pH 値がさまざまなサイズのクエン酸塩でコーティングされた銀ナノ粒子のコロイド安定性に大きな影響を与えることが証明されました。これらの系では、AgNP の表面にある負に帯電した -COO- 基によって安定性が提供されます。クエン酸イオンのカルボン酸官能基は、多数の H+ イオンでプロトン化されるため、図 4 の上段に示すように、生成されたカルボキシル基は粒子間に静電反発力を提供できなくなります。ル シャトリエの原理によれば、AgNPサンプルは pH 3 で急速に凝集しますが、pH が増加するにつれて徐々に安定します。
図 4 異なる pH (上の行)、NaCl 濃度 (中央の行)、および生体分子 (下の行) での凝集によって定義される表面相互作用の概略メカニズム。
図 5 によれば、塩濃度を増加させた場合の、さまざまなサイズの AgNP 懸濁液におけるコロイドの安定性も調べられました。ゼータ電位に基づくと、これらのクエン酸末端 AgNP システムのナノ粒子サイズの増加により、NaCl からの外部影響に対する耐性が強化されます。AgNP-I では、穏やかな凝集を誘導するには 10 mM NaCl で十分であり、50 mM の塩濃度でも非常に類似した結果が得られます。AgNP-II および AgNP-III では、値が (AgNP-II) 以下 (AgNP-III) -30 mV にとどまるため、10 mM NaCl はゼータ電位に大きな影響を与えません。NaCl 濃度を 50 mM、最終的に 150 mM NaCl に増加させると、すべてのサンプルのゼータ電位の絶対値を大幅に低下させることができますが、粒子が大きいほど負電荷がより多く保持されます。これらの結果は、AgNP の予想される平均流体力学的直径と一致しています。10、50、および 150 mM NaCl で測定された Z 平均傾向線は、異なる徐々に増加する値を示します。最後に、3 回の 150 mM 実験すべてでミクロンサイズの凝集体が検出されました。
図 5 サイズを増加させたクエン酸末端銀ナノ粒子サンプル (10 nm: AgNP-I、20 nm: AgNP-II、50 nm: AgNP-III) の動的光散乱結果は、平均流体力学的直径 (Z 平均) として表されます。 ) (右) とゼータ電位 (左) は、異なる NaCl 濃度下で 24 時間以内に変化します。
補足図 S2 の UV-Vis の結果は、3 つのサンプルすべてにおける 50 mM および 150 mM NaCl の SPR が瞬間的かつ大幅に減少していることを示しています。これは、NaCl ベースの凝集が pH 依存実験よりも速く起こるため、DLS によって説明できます。これは、初期 (0、1.5、および 3 時間) の測定間の大きな差によって説明されます。さらに、塩濃度を増加すると、実験媒体の比誘電率も増加し、表面プラズモン共鳴に大きな影響を及ぼします。29
NaCl の効果は、図 4 の中段にまとめられています。一般に、Na+ イオンはカルボン酸基の周りに配位する傾向があるため、塩化ナトリウム濃度の増加は酸性度の増加と同様の効果があると結論付けることができます。負のゼータ電位 AgNP を抑制します。さらに、150 mM NaCl は 3 つのサンプルすべてでミクロンサイズの凝集体を生成しました。これは、生理的電解質濃度がクエン酸末端 AgNP のコロイド安定性に有害であることを示しています。同様の AgNP システムでの NaCl の臨界凝縮濃度 (CCC) を考慮することにより、これらの結果を関連文献に巧みに組み込むことができます。フインら。El Badawy らは、平均直径 71 nm のクエン酸末端銀ナノ粒子の NaCl の CCC が 47.6 mM であると計算しました。クエン酸コーティングを施した 10 nm AgNP の CCC が 70 mM であることが観察されました。10,16 さらに、He らによって約 300 mM という非常に高い CCC が測定されましたが、これがその合成方法が前述の刊行物と異なる原因となっています。48 現在の貢献はこれらの値の包括的な分析を目的としたものではありませんが、実験条件が研究全体の複雑さを増しているため、生物学的に関連する NaCl 濃度 50 mM、特に 150 mM NaCl は非常に高いと思われます。凝固の誘発により、検出された強い変化が説明されます。
重合実験の次のステップは、単純だが生物学的に関連のある分子を使用して、ナノ粒子と生体分子の相互作用をシミュレートすることです。DLS (図 6 および 7) および UV-Vis の結果 (補足図 S3 および S4) に基づいて、いくつかの一般的な結論を主張できます。我々の実験条件下では、Z 平均傾向が対応する参照測定値と密接に関連しているため、研究対象の分子グルコースとグルタミンはどの AgNP システムでも凝集を誘発しません。それらの存在は凝集には影響しませんが、実験結果では、これらの分子が部分的に AgNP の表面に吸着していることが示されています。この見解を裏付ける最も顕著な結果は、観察された光吸収の変化です。AgNP-I は意味のある波長や強度の変化を示しませんが、より大きな粒子を測定することでより明確に観察できます。これは、おそらく前述したより高い光感度によるものと考えられます。濃度に関係なく、グルコースは対照測定と比較して1.5時間後により大きな赤方偏移を引き起こす可能性があり、これはAgNP-IIでは約40 nm、AgNP-IIIでは約10 nmであり、表面相互作用の発生を証明しています。グルタミンも同様の傾向を示しましたが、変化はそれほど明らかではありませんでした。さらに、グルタミンが中型および大型粒子の絶対ゼータ電位を低下させる可能性があることにも言及する価値があります。しかし、これらのゼータ変化は凝集レベルに影響を与えないようであるため、グルタミンのような小さな生体分子であっても粒子間にある程度の空間的反発を与えることができると推測できます。
図 6 サイズを増加させたクエン酸末端銀ナノ粒子サンプル (10 nm: AgNP-I、20 nm: AgNP-II、50 nm: AgNP-III) の動的光散乱の結果は、平均流体力学的直径 (Z 平均) として表されます。 (右) 異なるグルコース濃度の外部条件下では、ゼータ電位 (左) は 24 時間以内に変化します。
図 7 サイズを増加させたクエン酸末端銀ナノ粒子サンプル (10 nm: AgNP-I、20 nm: AgNP-II、50 nm: AgNP-III) の動的光散乱の結果は、平均流体力学的直径 (Z 平均) として表されます。 ) (右) グルタミンの存在下では、ゼータ電位 (左) は 24 時間以内に変化します。
つまり、グルコースやグルタミンなどの小さな生体分子は、測定された濃度ではコロイドの安定性に影響を与えません。ゼータ電位や UV-Vis の結果に程度の差はあれ、Z 平均の結果は一貫していません。これは、分子の表面吸着により静電反発が抑制され、同時に寸法安定性が得られることを示しています。
以前の結果を以前の結果と関連付け、生物学的条件をより巧みにシミュレートするために、最も一般的に使用される細胞培養成分のいくつかを選択し、それらを AgNP コロイドの安定性を研究するための実験条件として使用しました。インビトロ実験全体において、培地としての DMEM の最も重要な機能の 1 つは、必要な浸透圧条件を確立することですが、化学的な観点から見ると、DMEM は 150 mM NaCl と同様の総イオン強度を持つ複雑な塩溶液です。 。40 FBS に関しては、表面吸着の観点からは生体分子 (主にタンパク質) の複雑な混合物であり、化学組成と多様性にもかかわらず、グルコースやグルタミンの実験結果といくつかの類似点があります。セックスははるかに複雑です。19 DLS と UV - 図 8 と補足図 S5 にそれぞれ示されている目に見える結果は、これらの材料の化学組成を調べ、それらを前のセクションの測定値と相関させることで説明できます。
図 8 サイズを増加させたクエン酸末端銀ナノ粒子サンプル (10 nm: AgNP-I、20 nm: AgNP-II、50 nm: AgNP-III) の動的光散乱結果は、平均流体力学的直径 (Z 平均) として表されます。 ) (右) 細胞培養成分 DMEM および FBS の存在下では、ゼータ電位 (左) は 24 時間以内に変化します。
DMEM でのさまざまなサイズの AgNP の希釈は、コロイドの安定性に対して、高濃度の NaCl の存在下で観察される効果と同様の効果をもたらします。50 v/v% DMEM 中の AgNP の分散では、ゼータ電位と Z 平均値の増加、および SPR 強度の急激な減少を伴う大規模な凝集が検出されたことが示されました。24 時間後に DMEM によって誘発される最大凝集体サイズがプライマー ナノ粒子のサイズに反比例することは注目に値します。
FBS と AgNP 間の相互作用は、グルコースやグルタミンなどのより小さな分子の存在下で観察されるものと似ていますが、その効果はより強力です。粒子の Z 平均は影響を受けませんが、ゼータ電位の増加が検出されます。SPR ピークはわずかに赤方偏移を示しましたが、おそらくさらに興味深いことに、SPR 強度は対照測定ほど大幅には減少しませんでした。これらの結果は、ナノ粒子表面への高分子の生来の吸着によって説明できます (図 4 の下の列)。これは現在、体内での生体分子コロナの形成として理解されています。49