銀ナノ粒子 (AgNP) は、さまざまな病原体を制御するための潜在的に有用なツールであると考えられています。しかし、AgNP が環境媒体に放出されると、人間の健康や生態系に悪影響を与える可能性があるため、懸念されています。本研究では、さまざまなサイズの AgNP で修飾された新しいマイクロメートルサイズの磁性ハイブリッドコロイド (MHC) (AgNP-MHC) を開発し、評価しました。これらの粒子は、消毒に適用された後、磁気特性を利用して環境媒体から簡単に回収でき、ウイルス病原体を不活化する効果を維持します。我々は、バクテリオファージ ϕX174、マウスノロウイルス (MNV)、およびアデノウイルス血清型 2 (AdV2) を不活化する AgNP-MHC の有効性を評価しました。これらの標的ウイルスを 25℃で 1、3、および 6 時間 AgNP-MHC に曝露し、その後プラークアッセイおよびリアルタイム TaqMan PCR によって分析しました。AgNP-MHC をさまざまな環境条件下での抗ウイルス効果を評価するために、さまざまな pH レベルおよび水道水および地表水に曝露しました。試験した 3 種類の AgNP-MHC の中で、Ag30-MHC がウイルスの不活化に最も高い効果を示しました。4.6 × 109 Ag30-MHC/ml に 1 時間曝露した後、ϕX174 と MNV は 2 log10 以上減少しました。これらの結果は、AgNP-MHC を使用して、環境への放出の可能性を最小限に抑えながらウイルス病原体を不活化できることを示しました。

最近のナノテクノロジーの進歩により、ナノ粒子はバイオテクノロジー、医学、公衆衛生の分野で世界中でますます注目を集めています（1、2）。表面対体積比が高いため、通常 10 ～ 500 nm の範囲のナノサイズ材料は、より大きな材料と比較して独特の物理化学的特性を持っています (1）。ナノマテリアルの形状とサイズは制御でき、特定の官能基をその表面に結合させて、特定のタンパク質との相互作用や細胞内取り込みを可能にすることができます（3,–5).

銀ナノ粒子 (AgNP) は抗菌剤として広く研究されています (6）。銀は、高級カトラリーの作成、装飾品、治療薬などに使用されます。スルファジアジン銀や特定の塩などの銀化合物は、その抗菌特性により、創傷ケア製品や感染症の治療薬として使用されてきました。6、7）。最近の研究では、AgNP がさまざまな種類の細菌やウイルスの不活化に非常に効果的であることが明らかになりました (8,–11）。AgNP および AgNP から放出される Ag+ イオンは、DNA、RNA、タンパク質などのリンまたは硫黄を含む生体分子と直接相互作用します (12,–14）。また、活性酸素種 (ROS) を生成し、微生物の膜損傷を引き起こすことも示されています (15）。AgNP のサイズ、形状、濃度も、抗菌能力に影響を与える重要な要素です (8、10、13、16、17).

以前の研究でも、AgNP を水環境における病原菌の制御に使用する場合のいくつかの問題が強調されています。第一に、水中のウイルス病原体を不活化するための AgNP の有効性に関する既存の研究は限られています。さらに、単分散 AgNP は通常、サイズが小さく表面積が大きいため、粒子間凝集が起こりやすく、これらの凝集により微生物病原体に対する AgNP の有効性が低下します (7）。最後に、AgNP にはさまざまな細胞毒性作用があることが示されています (5、18,–20）、AgNP が水環境に放出されると、人間の健康や生態系に問題が生じる可能性があります。

最近、さまざまなサイズの AgNP で修飾された新しいマイクロメートルサイズの磁性ハイブリッドコロイド (MHC) を開発しました (21、22）。MHC コアは、環境から AgNP 複合材料を回収するために使用できます。私たちは、バクテリオファージ ϕX174、マウスノロウイルス (MNV)、およびアデノウイルスを使用して、さまざまな環境条件下で MHC (AgNP-MHC) に対するこれらの銀ナノ粒子の抗ウイルス効果を評価しました。

バクテリオファージ ϕX174 (a)、MNV (b)、および AdV2 (c) に対するさまざまな濃度の AgNP-MHC の抗ウイルス効果。標的ウイルスを、振盪インキュベーター（150 rpm、1時間、25℃）内で、さまざまな濃度のAgNP-MHC、および対照としてOH-MHC（4.6×109粒子/ml）で処理しました。プラークアッセイ法を使用して、生存ウイルスを測定しました。値は、3 回の独立した実験からの平均値 ± 標準偏差 (SD) です。アスタリスクは、大きく異なる値を示します (Pダネット検定による一元配置分散分析による < 0.05)。

この研究は、AgNP-MHC が水中でバクテリオファージおよびヒトノロウイルスの代替物である MNV を不活化するのに有効であることを実証しました。さらに、AgNP-MHC は磁石で簡単に回収できるため、潜在的に有毒な AgNP の環境への放出を効果的に防止できます。これまでの多くの研究で、AgNP の濃度と粒子サイズが標的微生物を不活化する重要な要素であることが示されています (8、16、17）。AgNP の抗菌効果は微生物の種類にも依存します。φX174 を不活化する AgNP-MHC の有効性は、用量反応関係に従いました。試験した AgNP-MHC の中で、Ag30-MHC は、φX174 および MNV を不活化する効果がより高かった。MNV では、Ag30-MHC のみが抗ウイルス活性を示し、他の AgNP-MHC は MNV の有意な不活化を引き起こしませんでした。どの AgNP-MHC も、AdV2 に対して有意な抗ウイルス活性を有していませんでした。

粒子サイズに加えて、AgNP-MHC 中の銀の濃度も重要でした。銀の濃度は、AgNP-MHC の抗ウイルス効果の有効性を決定すると考えられます。4.6 × 109 粒子/ml の Ag07-MHC および Ag30-MHC の溶液中の銀濃度は、それぞれ 28.75 ppm および 200 ppm であり、抗ウイルス活性のレベルと相関していました。表2試験した AgNP-MHC の銀濃度と表面積をまとめています。Ag07-MHC は最も低い抗ウイルス活性を示し、銀濃度と表面積が最も低く、これらの特性が AgNP-MHC の抗ウイルス活性に関連していることが示唆されました。

私たちの以前の研究では、AgNP-MHC の主な抗菌メカニズムは、微生物の膜からの Mg2+ または Ca2+ イオンの化学的抽出、膜に位置するチオール基との複合体の生成、および活性酸素種 (ROS) の生成であることが示されました。21）。AgNP-MHC は比較的大きな粒径 (約 500 nm) を持っているため、ウイルスのカプシドを貫通できる可能性は低いです。代わりに、AgNP-MHC はウイルス表面タンパク質と相互作用すると考えられます。複合材料上の AgNP は、ウイルスのコートタンパク質に埋め込まれたチオール基含有生体分子に結合する傾向があります。したがって、ウイルスキャプシドタンパク質の生化学的特性は、AgNP-MHC に対する感受性を決定するために重要です。図1図は、AgNP-MHC の影響に対するウイルスのさまざまな感受性を示しています。バクテリオファージ ϕX174 および MNV は AgNP-MHC に対して感受性がありましたが、AdV2 は耐性でした。AdV2 の高い耐性レベルは、そのサイズと構造に関連している可能性があります。アデノウイルスのサイズは 70 ～ 100 nm です (30)、ϕX174 (27 ～ 33 nm) および MNV (28 ～ 35 nm) よりもはるかに大きくなります (31、32）。アデノウイルスは、その大きなサイズに加えて、他のウイルスとは異なり二本鎖 DNA を持ち、熱や紫外線などのさまざまな環境ストレスに耐性があります (33、34）。私たちの以前の研究では、Ag30-MHC を使用すると 6 時間以内に MS2 のほぼ 3-log10 の減少が起こったと報告されました (21）。MS2 と ϕX174 は、異なる種類の核酸 (RNA または DNA) を備えた同様のサイズを持っていますが、Ag30-MHC による不活化速度は同様です。したがって、核酸の性質は、AgNP-MHC に対する耐性の主要な要因ではないようです。アデノウイルスははるかに大きいウイルスであるため、代わりに、ウイルス粒子のサイズと形状がより重要であると考えられます。Ag30-MHC は、6 時間以内に M13 のほぼ 2-log10 の減少を達成しました (未発表データ)。M13 は一本鎖 DNA ウイルス (35)、長さは約 880 nm、直径は 6.6 nm (36）。糸状バクテリオファージ M13 の不活化速度は、小型の円形構造ウイルス (MNV、φX174、および MS2) と大型ウイルス (AdV2) の中間でした。

本研究では、MNV の不活化動態はプラークアッセイと RT-PCR アッセイで大きく異なりました (図2bそしておよびc).c）。RT-PCR などの分子アッセイは、ウイルスの不活化率を大幅に過小評価することが知られています (25、28）、私たちの研究で判明したように。AgNP-MHC は主にウイルス表面と相互作用するため、ウイルス核酸よりもウイルスコートタンパク質を損傷する可能性が高くなります。したがって、ウイルス核酸を測定するための RT-PCR アッセイでは、ウイルスの不活化が大幅に過小評価される可能性があります。Ag+ イオンの効果と活性酸素種 (ROS) の生成が、テストされたウイルスの不活化の原因となるはずです。しかし、AgNP-MHC の抗ウイルスメカニズムの多くの側面はまだ不明であり、AdV2 の高い耐性のメカニズムを解明するには、バイオテクノロジー的アプローチを使用したさらなる研究が必要です。

最後に、抗ウイルス活性を測定する前に、Ag30-MHC を広範囲の pH 値と水道水および地表水のサンプルに曝露することで、その抗ウイルス活性の堅牢性を評価しました (図3そしておよび4).4）。極度に低い pH 条件にさらされると、MHC から AgNP が物理的および/または機能的に失われます (未発表データ)。非特異的粒子の存在下では、MS2 に対する抗ウイルス活性は低下したにもかかわらず、Ag30-MHC は一貫して抗ウイルス活性を示しました。抗ウイルス活性は、ろ過されていない地表水で最も低くなりました。これは、高度に濁った地表水中の Ag30-MHC と非特異的粒子との間の相互作用がおそらく抗ウイルス活性の低下を引き起こしたためです (表3）。したがって、将来的には、さまざまな種類の水（たとえば、異なる塩濃度またはフミン酸）中での AgNP-MHC のフィールド評価を実行する必要があります。

結論として、新しい銀複合材料である AgNP-MHC は、ϕX174 や MNV を含むいくつかのウイルスに対して優れた抗ウイルス能力を備えています。AgNP-MHC はさまざまな環境条件下でも強力な効果を維持し、これらの粒子は磁石を使用して簡単に回収できるため、人間の健康や環境に対する潜在的な悪影響を軽減できます。この研究は、AgNP 複合材料が、重大な生態学的リスクを伴うことなく、さまざまな環境設定において効果的な抗ウイルス剤となり得ることを示しました。