Javascript er for øyeblikket deaktivert i nettleseren din.Når javascript er deaktivert, vil enkelte funksjoner på denne nettsiden ikke fungere.
Registrer dine spesifikke detaljer og spesifikke medisiner av interesse, og vi vil matche informasjonen du gir med artikler i vår omfattende database og sende deg en PDF-kopi via e-post i tide.
Er mindre nanopartikler alltid bedre?Forstå de biologiske effektene av størrelsesavhengig aggregering av sølvnanopartikler under biologisk relevante forhold
Forfattere: Bélteky P, Rónavári A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Kónya Z
Péter Bélteky,1,* Andrea Rónavári,1,* Dalma Zakupszky,1 Eszter Boka,1 Nóra Igaz,2 Bettina Szerencsés,3 Ilona Pfeiffer,3 Csaba Vágvölgyi,3 Mónika Kiricsi fra miljøkjemi, Ungarn, vitenskap og informatikk i Ungarn , Universitetet i Szeged;2 Institutt for biokjemi og molekylærbiologi, Fakultet for naturvitenskap og informasjon, Universitetet i Szeged, Ungarn;3 Institutt for mikrobiologi, Fakultet for naturvitenskap og informasjon, Universitetet i Szeged, Ungarn;4MTA-SZTE Reaction Kinetics and Surface Chemistry Research Group, Szeged, Ungarn* Disse forfatterne bidro like mye til dette arbeidet.Kommunikasjon: Zoltán Kónya Institutt for anvendt og miljøkjemi, Fakultet for naturvitenskap og informatikk, Universitetet i Szeged, Rerrich Square 1, Szeged, H-6720, Ungarn Telefon +36 62 544620 E-post [E-postbeskyttelse] Formål: Sølvnanopartikler (AgNP) er et av de mest studerte nanomaterialene, spesielt på grunn av deres biomedisinske anvendelser.Imidlertid, på grunn av aggregeringen av nanopartikler, blir deres utmerkede cytotoksisitet og antibakterielle aktivitet ofte kompromittert i biologiske medier.I dette arbeidet ble aggregeringsatferden og relaterte biologiske aktiviteter til tre forskjellige sitratterminerte sølvnanopartikkelprøver med en gjennomsnittlig diameter på 10, 20 og 50 nm studert.Metode: Bruk transmisjonselektronmikroskop til å syntetisere og karakterisere nanopartikler, evaluere deres aggregeringsadferd ved ulike pH-verdier, NaCl, glukose og glutaminkonsentrasjoner ved dynamisk lysspredning og ultrafiolett-synlig spektroskopi.I tillegg forbedrer komponenter som Dulbecco i cellekulturmediet aggregeringsadferden i Eagle Medium og Fetal Calf Serum.Resultater: Resultatene viser at sur pH og fysiologisk elektrolyttinnhold generelt induserer aggregering i mikronskala, som kan medieres ved dannelse av biomolekylær korona.Det er verdt å merke seg at større partikler viser høyere motstand mot ytre påvirkninger enn deres mindre motparter.In vitro cytotoksisitet og antibakterielle tester ble utført ved å behandle celler med nanopartikkelaggregater på forskjellige aggregeringsstadier.Konklusjon: Resultatene våre avslører en dyp korrelasjon mellom kolloidal stabilitet og toksisiteten til AgNP, da ekstrem aggregering fører til fullstendig tap av biologisk aktivitet.Den høyere graden av anti-aggregering observert for større partikler har en betydelig innvirkning på in vitro toksisitet, fordi slike prøver beholder mer antimikrobiell og pattedyrcelleaktivitet.Disse funnene fører til konklusjonen at til tross for den generelle oppfatningen i relevant litteratur, er det kanskje ikke den beste handlingen å sikte på de minste mulige nanopartikler.Nøkkelord: frømediert vekst, kolloidal stabilitet, størrelsesavhengig aggregeringsatferd, toksisitet for aggregeringsskade
Ettersom etterspørselen og produksjonen av nanomaterialer fortsetter å øke, rettes mer og mer oppmerksomhet til deres biosikkerhet eller biologiske aktivitet.Sølv nanopartikler (AgNP) er en av de mest syntetiserte, undersøkte og brukte representantene for denne klassen av materialer på grunn av deres utmerkede katalytiske, optiske og biologiske egenskaper.1 Det antas generelt at de unike egenskapene til nanomaterialer (inkludert AgNP-er) hovedsakelig tilskrives deres store spesifikke overflateareal.Derfor er det uunngåelige problemet enhver prosess som påvirker denne nøkkelfunksjonen, for eksempel partikkelstørrelse, overflatebelegg eller aggregering, om det vil skade egenskapene til nanopartikler som er kritiske for spesifikke bruksområder alvorlig.
Effektene av partikkelstørrelse og stabilisatorer er emner som er relativt godt dokumentert i litteraturen.For eksempel er det allment aksepterte synet at mindre nanopartikler er mer giftige enn større nanopartikler.2 I samsvar med generell litteratur har våre tidligere studier vist den størrelsesavhengige aktiviteten til nanosølv på pattedyrceller og mikroorganismer.3– 5 Overflatebelegg er en annen egenskap som har bred innflytelse på egenskapene til nanomaterialer.Bare ved å legge til eller modifisere stabilisatorer på overflaten, kan det samme nanomaterialet ha helt forskjellige fysiske, kjemiske og biologiske egenskaper.Påføringen av kappemidler utføres oftest som en del av nanopartikkelsyntese.For eksempel er citratterminerte sølvnanopartikler en av de mest relevante AgNP-ene i forskningen, som syntetiseres ved å redusere sølvsalter i en valgt stabilisatorløsning som reaksjonsmedium.6 Citrate kan enkelt dra nytte av dets lave kostnader, tilgjengelighet, biokompatibilitet og sterke affinitet for sølv, noe som kan reflekteres i ulike foreslåtte interaksjoner, fra reversibel overflateadsorpsjon til ioniske interaksjoner.Små molekyler og polyatomære ioner nær 7,8, slik som sitrater, polymerer, polyelektrolytter og biologiske midler, brukes også ofte for å stabilisere nano-sølv og utføre unike funksjonaliseringer på det.9-12
Selv om muligheten for å endre aktiviteten til nanopartikler ved tilsiktet overflatekapping er et veldig interessant område, er hovedrollen til dette overflatebelegget ubetydelig, og gir kolloidal stabilitet for nanopartikkelsystemet.Det store spesifikke overflatearealet til nanomaterialer vil produsere stor overflateenergi, noe som hindrer systemets termodynamiske evne til å nå minimumsenergien.13 Uten skikkelig stabilisering kan dette føre til agglomerering av nanomaterialer.Aggregering er dannelsen av aggregater av partikler av forskjellige former og størrelser som oppstår når dispergerte partikler møtes og nåværende termodynamiske interaksjoner lar partiklene feste seg til hverandre.Derfor brukes stabilisatorer for å forhindre aggregering ved å innføre en tilstrekkelig stor frastøtende kraft mellom partiklene for å motvirke deres termodynamiske tiltrekning.14
Selv om emnet partikkelstørrelse og overflatedekning har blitt grundig utforsket i sammenheng med reguleringen av biologiske aktiviteter utløst av nanopartikler, er partikkelaggregering et stort sett forsømt område.Det er nesten ingen grundig studie for å løse den kolloidale stabiliteten til nanopartikler under biologisk relevante forhold.10,15-17 I tillegg er dette bidraget spesielt sjeldent, der toksisiteten assosiert med aggregering også er studert, selv om det kan forårsake uønskede reaksjoner, som vaskulær trombose, eller tap av ønskede egenskaper, som toksisitet, som vist i figur 1.18, 19 vist.Faktisk er en av de få kjente mekanismene for sølvnanopartikkelresistens relatert til aggregering, fordi visse E. coli- og Pseudomonas aeruginosa-stammer er rapportert å redusere deres nano-sølvfølsomhet ved å uttrykke proteinet flagellin, flagellin.Den har høy affinitet for sølv, og induserer dermed aggregering.20
Det er flere forskjellige mekanismer knyttet til toksisiteten til sølvnanopartikler, og aggregering påvirker alle disse mekanismene.Den mest diskuterte metoden for AgNP biologisk aktivitet, noen ganger referert til som "Trojan Horse"-mekanismen, ser på AgNP som Ag+-bærere.1,21 Den trojanske hestemekanismen kan sikre en stor økning i den lokale Ag+-konsentrasjonen, noe som fører til generering av ROS og membrandepolarisering.22-24 Aggregering kan påvirke frigjøringen av Ag+, og dermed påvirke toksisiteten, fordi den reduserer den effektive aktive overflaten hvor sølvioner kan oksideres og oppløses.Imidlertid vil AgNP ikke bare vise toksisitet gjennom ionefrigjøring.Mange størrelses- og morfologirelaterte interaksjoner må vurderes.Blant dem er størrelsen og formen på nanopartikkeloverflaten de definerende egenskapene.4,25 Samlingen av disse mekanismene kan kategoriseres som "induserte toksisitetsmekanismer."Det er potensielt mange mitokondrie- og overflatemembranreaksjoner som kan skade organeller og forårsake celledød.25-27 Siden dannelsen av aggregater naturlig påvirker størrelsen og formen til sølvholdige gjenstander som gjenkjennes av levende systemer, kan disse interaksjonene også bli påvirket.
I vår forrige artikkel om aggregering av sølvnanopartikler demonstrerte vi en effektiv screeningsprosedyre bestående av kjemiske og in vitro biologiske eksperimenter for å studere dette problemet.19 Dynamisk lysspredning (DLS) er den foretrukne teknikken for denne typen inspeksjoner fordi materialet kan spre fotoner med en bølgelengde som kan sammenlignes med størrelsen på partiklene.Siden den Brownske bevegelseshastigheten til partikler i det flytende mediet er relatert til størrelsen, kan endringen i intensiteten til spredt lys brukes til å bestemme den gjennomsnittlige hydrodynamiske diameteren (Z-middel) til væskeprøven.28 I tillegg, ved å påføre en spenning på prøven, kan zetapotensialet (ζ-potensialet) til nanopartikkelen måles på samme måte som Z-middelverdien.13,28 Hvis absoluttverdien av zetapotensialet er høy nok (i henhold til generelle retningslinjer> ±30 mV), vil det generere sterk elektrostatisk frastøtning mellom partiklene for å motvirke aggregeringen.Karakteristisk overflateplasmonresonans (SPR) er et unikt optisk fenomen, hovedsakelig tilskrevet nanopartikler av edelt metall (hovedsakelig Au og Ag).29​​ Basert på de elektroniske oscillasjonene (overflateplasmoner) til disse materialene på nanoskala, er det kjent at sfæriske AgNP-er har en karakteristisk UV-Vis-absorpsjonstopp nær 400 nm.30 Intensiteten og bølgelengdeforskyvningen til partiklene brukes for å supplere DLS-resultatene, da denne metoden kan brukes til å oppdage nanopartikkelaggregering og overflateadsorpsjon av biomolekyler.
Basert på informasjonen som er oppnådd, utføres cellelevedyktighet (MTT) og antibakterielle analyser på en måte der AgNP-toksisitet beskrives som en funksjon av aggregeringsnivå, snarere enn (den mest brukte faktoren) nanopartikkelkonsentrasjon.Denne unike metoden lar oss demonstrere den dype betydningen av aggregeringsnivå i biologisk aktivitet, fordi for eksempel sitratterminerte AgNP-er fullstendig mister sin biologiske aktivitet i løpet av få timer på grunn av aggregering.19
I det nåværende arbeidet tar vi sikte på å utvide våre tidligere bidrag i stabiliteten til biorelaterte kolloider og deres innvirkning på biologisk aktivitet ved å studere effekten av nanopartikkelstørrelse på nanopartikkelaggregering.Dette er utvilsomt en av studiene av nanopartikler.Et høyere profilert perspektiv og 31 For å undersøke dette problemet ble en frømediert vekstmetode brukt for å produsere sitratterminerte AgNP-er i tre forskjellige størrelsesområder (10, 20 og 50 nm).6,32 som en av de vanligste metodene.For nanomaterialer som er mye og rutinemessig brukt i medisinske applikasjoner, velges sitratterminerte AgNP-er av forskjellige størrelser for å studere den mulige størrelsesavhengigheten til de aggregeringsrelaterte biologiske egenskapene til nanosølv.Etter å ha syntetisert AgNP-er av forskjellige størrelser, karakteriserte vi de produserte prøvene ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM), og undersøkte deretter partiklene ved å bruke den nevnte screeningprosedyren.I tillegg, i nærvær av in vitro cellekulturer Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) og Fetal Bovine Serum (FBS), ble den størrelsesavhengige aggregeringsatferden og dens oppførsel evaluert ved forskjellige pH-verdier, NaCl, glukose og glutaminkonsentrasjoner.Karakteristikkene til cytotoksisitet bestemmes under omfattende forhold.Den vitenskapelige konsensus indikerer at generelt er mindre partikler å foretrekke;vår undersøkelse gir en kjemisk og biologisk plattform for å avgjøre om dette er tilfelle.
Tre sølvnanopartikler med forskjellige størrelsesområder ble fremstilt ved den frømedierte vekstmetoden foreslått av Wan et al., med små justeringer.6 Denne metoden er basert på kjemisk reduksjon, ved bruk av sølvnitrat (AgNO3) som sølvkilde, natriumborhydrid (NaBH4) som reduksjonsmiddel og natriumcitrat som stabilisator.Tilbered først 75 mL 9 mM vandig sitratløsning fra natriumsitratdihydrat (Na3C6H5O7 x 2H2O) og varm opp til 70°C.Deretter ble 2 ml 1% vekt/volum AgNO3-løsning tilsatt til reaksjonsmediet, og deretter ble den nyfremstilte natriumborhydridløsningen (2 ml 0,1% vekt/volum) helt dråpevis inn i blandingen.Den resulterende gulbrune suspensjonen ble holdt ved 70°C under kraftig omrøring i 1 time og deretter avkjølt til romtemperatur.Den resulterende prøven (referert til som AgNP-I fra nå av) brukes som grunnlag for frø-mediert vekst i neste syntesetrinn.
For å syntetisere en mellomstor partikkelsuspensjon (betegnet som AgNP-II), oppvarm 90 mL 7,6 mM sitratløsning til 80°C, bland den med 10 mL AgNP-I og bland deretter 2 mL 1 % w/v AgNO3-løsningen ble holdt under kraftig mekanisk omrøring i 1 time, og deretter ble prøven avkjølt til romtemperatur.
For den største partikkelen (AgNP-III), gjenta den samme vekstprosessen, men bruk i dette tilfellet 10 ml AgNP-II som frøsuspensjon.Etter at prøvene har nådd romtemperatur, setter de sin nominelle Ag-konsentrasjon basert på det totale AgNO3-innholdet til 150 ppm ved å tilsette eller fordampe ytterligere løsningsmiddel ved 40 °C, og til slutt lagre dem ved 4 °C til videre bruk.
Bruk FEI Tecnai G2 20 X-Twin Transmission Electron Microscope (TEM) (FEI Corporate Headquarters, Hillsboro, Oregon, USA) med 200 kV akselerasjonsspenning for å undersøke de morfologiske egenskapene til nanopartikler og fange deres elektrondiffraksjonsmønster (ED).Minst 15 representative bilder (~750 partikler) ble evaluert ved hjelp av ImageJ-programvarepakken, og de resulterende histogrammene (og alle grafene i hele studien) ble laget i OriginPro 2018 (OriginLab, Northampton, MA, USA) 33, 34.
Gjennomsnittlig hydrodynamisk diameter (Z-gjennomsnitt), zetapotensial (ζ-potensial) og karakteristisk overflateplasmonresonans (SPR) til prøvene ble målt for å illustrere deres opprinnelige kolloidale egenskaper.Den gjennomsnittlige hydrodynamiske diameteren og zetapotensialet til prøven ble målt med Malvern Zetasizer Nano ZS-instrumentet (Malvern Instruments, Malvern, Storbritannia) ved bruk av engangsbrettede kapillærceller ved 37±0,1°C.Ocean Optics 355 DH-2000-BAL UV-Vis-spektrofotometer (Halma PLC, Largo, FL, USA) ble brukt for å oppnå karakteristiske SPR-karakteristikker fra UV-Vis-absorpsjonsspektra til prøver i området 250-800 nm.
Under hele forsøket ble det utført tre ulike måletyper knyttet til kolloidal stabilitet samtidig.Bruk DLS til å måle den gjennomsnittlige hydrodynamiske diameteren (Z-gjennomsnitt) og zeta-potensialet (ζ-potensial) til partiklene, fordi Z-gjennomsnittet er relatert til gjennomsnittsstørrelsen på nanopartikkelaggregatene, og zeta-potensialet indikerer om den elektrostatiske frastøtingen i systemet er sterk nok til å oppveie Van der Waals tiltrekning mellom nanopartikler.Målinger gjøres i tre eksemplarer, og standardavviket for Z-middel og zeta-potensial beregnes av Zetasizer-programvaren.De karakteristiske SPR-spektrene til partiklene blir evaluert ved UV-Vis-spektroskopi, fordi endringer i toppintensitet og bølgelengde kan indikere aggregering og overflateinteraksjoner.29,35 Faktisk er overflateplasmonresonans i edle metaller så innflytelsesrik at den har ført til nye metoder for analyse av biomolekyler.29,36,37 Konsentrasjonen av AgNP i den eksperimentelle blandingen er ca. 10 ppm, og hensikten er å sette intensiteten av den maksimale initiale SPR-absorpsjonen til 1. Forsøket ble utført på en tidsavhengig måte til 0;1,5;3;6;12 og 24 timer under ulike biologisk relevante forhold.Flere detaljer som beskriver eksperimentet kan sees i vårt tidligere arbeid.19 Kort sagt ulike pH-verdier (3; 5; 7,2 og 9), forskjellige natriumklorid- (10 mM; 50 mM; 150 mM), glukose (3,9 mM; 6,7 mM) og glutamin (4 mM) konsentrasjoner, og også utarbeidet Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) og Fetal Bovine Serum (FBS) (i vann og DMEM) som modellsystemer, og studerte deres effekter på aggregeringsoppførselen til de syntetiserte sølvnanopartikler.pH Verdiene av NaCl, glukose og glutamin vurderes basert på fysiologiske konsentrasjoner, mens mengdene av DMEM og FBS er de samme som nivåene brukt i hele in vitro-eksperimentet.38-42 Alle målinger ble utført ved pH 7,2 og 37°C med en konstant bakgrunnssaltkonsentrasjon på 10 mM NaCl for å eliminere eventuelle langdistanse partikkelinteraksjoner (bortsett fra visse pH- og NaCl-relaterte eksperimenter, hvor disse attributtene er variablene under studere).28 Listen over ulike forhold er oppsummert i tabell 1. Forsøket merket med † brukes som referanse og tilsvarer en prøve som inneholder 10 mM NaCl og pH 7,2.
Human prostatakreftcellelinje (DU145) og udødeliggjorte humane keratinocytter (HaCaT) ble hentet fra ATCC (Manassas, VA, USA).Celler dyrkes rutinemessig i Dulbeccos minimum essensielle medium Eagle (DMEM) som inneholder 4,5 g/l glukose (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), supplert med 10 % FBS, 2 mM L-glutamin, 0,01 % streptomycin og 0,005 % Penicillin (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA).Cellene dyrkes i en 37°C inkubator under 5 % CO2 og 95 % fuktighet.
For å utforske endringene i AgNP cytotoksisitet forårsaket av partikkelaggregering på en tidsavhengig måte, ble en totrinns MTT-analyse utført.Først ble levedyktigheten til de to celletypene målt etter behandling med AgNP-I, AgNP-II og AgNP-III.For dette formål ble de to celletypene sådd inn i 96-brønners plater med en tetthet på 10 000 celler/brønn og behandlet med tre forskjellige størrelser av sølvnanopartikler i økende konsentrasjoner den andre dagen.Etter 24 timers behandling ble cellene vasket med PBS og inkubert med 0,5 mg/ml MTT-reagens (SERVA, Heidelberg, Tyskland) fortynnet i kulturmedium i 1 time ved 37°C.Formazan-krystaller ble oppløst i DMSO (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), og absorpsjonen ble målt ved 570 nm ved bruk av en Synergy HTX plateleser (BioTek-Hungary, Budapest, Ungarn).Absorpsjonsverdien til den ubehandlede kontrollprøven anses å være 100 % overlevelsesrate.Utfør minst 3 eksperimenter med fire uavhengige biologiske replikater.IC50 beregnes fra en doseresponskurve basert på vitalitetsresultater.
Deretter, i det andre trinnet, ved å inkubere partiklene med 150 mM NaCl i forskjellige tidsperioder (0, 1,5, 3, 6, 12 og 24 timer) før cellebehandling, ble forskjellige aggregeringstilstander av sølvnanopartikler produsert.Deretter ble den samme MTT-analysen utført som tidligere beskrevet for å evaluere endringer i cellelevedyktighet påvirket av partikkelaggregering.Bruk GraphPad Prism 7 til å evaluere det endelige resultatet, beregne den statistiske signifikansen av eksperimentet ved uparet t-test, og merk nivået som * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01), *** (p ≤ 0,001 ) Og **** (p ≤ 0,0001).
Tre forskjellige størrelser av sølvnanopartikler (AgNP-I, AgNP-II og AgNP-III) ble brukt for antibakteriell mottakelighet for Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM; Research Center for Pathogenic Fungi and Microbial Toxicology, Chiba University) og Bacillus Test megaterium SZMC 6031 (SZMC: Szeged Microbiology Collection) og E. coli SZMC 0582 i RPMI 1640-medium (Sigma-Aldrich Co.).For å evaluere endringene i antibakteriell aktivitet forårsaket av aggregering av partikler, ble først deres minste inhibitoriske konsentrasjon (MIC) bestemt ved mikrofortynning i en 96-brønners mikrotiterplate.Til 50 μL standardisert cellesuspensjon (5 × 104 celler/ml i RPMI 1640 medium), tilsett 50 μL sølv nanopartikkelsuspensjon og seriefortynn to ganger konsentrasjonen (i det nevnte mediet er området 0 og 75 ppm, dvs. kontrollprøven inneholder 50 μL cellesuspensjon og 50 μL medium uten nanopartikler).Deretter ble platen inkubert ved 30°C i 48 timer, og den optiske tettheten til kulturen ble målt ved 620 nm ved bruk av en SPECTROstar Nano plateleser (BMG LabTech, Offenburg, Tyskland).Eksperimentet ble utført tre ganger i tre eksemplarer.
Bortsett fra at 50 μL av enkelt aggregerte nanopartikkelprøver ble brukt på dette tidspunktet, ble samme prosedyre som tidligere beskrevet brukt for å undersøke effekten av aggregering på antibakteriell aktivitet på de nevnte stammene.Ulike aggregeringstilstander av sølvnanopartikler produseres ved å inkubere partiklene med 150 mM NaCl i forskjellige tidsperioder (0, 1,5, 3, 6, 12 og 24 timer) før cellebehandling.En suspensjon supplert med 50 μL RPMI 1640-medium ble brukt som vekstkontroll, mens det for å kontrollere toksisitet ble brukt en suspensjon med ikke-aggregerte nanopartikler.Eksperimentet ble utført tre ganger i tre eksemplarer.Bruk GraphPad Prism 7 til å evaluere det endelige resultatet på nytt ved å bruke samme statistiske analyse som MTT-analysen.
Aggregeringsnivået til de minste partiklene (AgNP-I) er karakterisert, og resultatene ble delvis publisert i vårt tidligere arbeid, men for en bedre sammenligning ble alle partiklene grundig screenet.De eksperimentelle dataene samles inn og diskuteres i de følgende avsnittene.Tre størrelser av AgNP.19
Målinger utført av TEM, UV-Vis og DLS bekreftet den vellykkede syntesen av alle AgNP-prøver (figur 2A-D).I henhold til den første raden i figur 2 viser den minste partikkelen (AgNP-I) en jevn sfærisk morfologi med en gjennomsnittlig diameter på ca. 10 nm.Den frømedierte vekstmetoden gir også AgNP-II og AgNP-III forskjellige størrelsesområder med gjennomsnittlig partikkeldiameter på henholdsvis ca. 20 nm og 50 nm.I henhold til standardavviket til partikkelfordelingen overlapper ikke størrelsene på de tre prøvene, noe som er viktig for deres komparative analyse.Ved å sammenligne gjennomsnittlig sideforhold og tynnhetsforhold til TEM-baserte partikkel 2D-projeksjoner, antas det at sfærisiteten til partiklene blir evaluert av ImageJs plug-in for formfilter (Figur 2E).43 I følge analysen av formen til partikler påvirkes ikke deres sideforhold (stor side/kortside av det minste avgrensende rektangelet) av partikkelvekst, og deres tynnhetsforhold (målt areal av den tilsvarende perfekte sirkelen/teoretiske området) ) avtar gradvis.Dette resulterer i flere og flere polyedriske partikler, som i teorien er perfekt runde, tilsvarende et tynnhetsforhold på 1.
Figur 2 Transmisjonselektronmikroskop (TEM) bilde (A), elektrondiffraksjon (ED) mønster (B), størrelsesfordelingshistogram (C), karakteristisk ultrafiolett-synlig (UV-Vis) lysabsorpsjonsspektrum (D) og gjennomsnittlig væskesitrat -terminerte sølvnanopartikler med mekanisk diameter (Z-gjennomsnitt), zetapotensial, sideforhold og tykkelsesforhold (E) har tre forskjellige størrelsesområder: AgNP-I er 10 nm (øverste rad), AgNP -II er 20 nm (midtrad). AgNP-III (nederste rad) er 50 nm.
Selv om den sykliske naturen til vekstmetoden påvirket partikkelformen til en viss grad, noe som resulterte i den mindre sfærisiteten til større AgNP-er, forble alle tre prøvene kvasi-sfæriske.I tillegg, som vist i elektrondiffraksjonsmønsteret i figur 2B, nano. Krystalliniteten til partiklene påvirkes ikke.Den fremtredende diffraksjonsringen - som kan korreleres med (111), (220), (200) og (311) Miller-indeksene for sølv - er veldig konsistent med den vitenskapelige litteraturen og våre tidligere bidrag.9, 19,44 Fragmenteringen av Debye-Scherrer-ringen til AgNP-II og AgNP-III skyldes at ED-bildet fanges opp med samme forstørrelse, slik at når partikkelstørrelsen øker, vil antall diffrakterte partikler pr. enhetsareal øker og minker.
Størrelsen og formen på nanopartikler er kjent for å påvirke biologisk aktivitet.3,45 Formavhengig katalytisk og biologisk aktivitet kan forklares med det faktum at forskjellige former har en tendens til å spre seg visse krystallflater (som har forskjellige Miller-indekser), og disse krystallflatene har forskjellige aktiviteter.45,46 Siden de preparerte partiklene gir lignende ED-resultater som tilsvarer svært like krystallkarakteristikker, kan det antas at i våre påfølgende eksperimenter med kolloidal stabilitet og biologisk aktivitet, bør eventuelle observerte forskjeller tilskrives nanopartikkelstørrelse, ikke formrelaterte egenskaper.
UV-Vis-resultatene oppsummert i figur 2D understreker ytterligere den overveldende sfæriske naturen til det syntetiserte AgNP, fordi SPR-toppene til alle tre prøvene er rundt 400 nm, som er en karakteristisk verdi for sfæriske sølvnanopartikler.29,30 De fangede spektrene bekreftet også den vellykkede frømedierte veksten av nanosølv.Ettersom partikkelstørrelsen øker, vil bølgelengden som tilsvarer maksimal lysabsorpsjon av AgNP-II-mer fremtredende-Ifølge litteraturen, AgNP-III Opplevde en rødforskyvning.6,29
Når det gjelder den innledende kolloidale stabiliteten til AgNP-systemet, ble DLS brukt til å måle den gjennomsnittlige hydrodynamiske diameteren og zetapotensialet til partiklene ved pH 7,2.Resultatene avbildet i figur 2E viser at AgNP-III har høyere kolloidal stabilitet enn AgNP-I eller AgNP-II, fordi vanlige retningslinjer indikerer at et zetapotensial på 30 mV absolutt er nødvendig for langsiktig kolloidal stabilitet. Dette funnet støttes ytterligere når Z-gjennomsnittsverdien (oppnådd som den gjennomsnittlige hydrodynamiske diameteren til frie og aggregerte partikler) sammenlignes med den primære partikkelstørrelsen oppnådd av TEM, fordi jo nærmere de to verdiene er, jo mildere grad Samling i prøven.Faktisk er Z-gjennomsnittet av AgNP-I og AgNP-II rimelig høyere enn deres viktigste TEM-evaluerte partikkelstørrelse, så sammenlignet med AgNP-III er disse prøvene spådd å ha større sannsynlighet for å aggregere, der det svært negative zetapotensialet er ledsaget av en tett størrelse Z-gjennomsnittsverdien.
Forklaringen på dette fenomenet kan være todelt.På den ene siden holdes sitratkonsentrasjonen på et lignende nivå i alle syntesetrinn, og gir en relativt høy mengde ladede overflategrupper for å forhindre at det spesifikke overflatearealet til de voksende partiklene avtar.Imidlertid, ifølge Levak et al., kan små molekyler som sitrat lett byttes ut av biomolekyler på overflaten av nanopartikler.I dette tilfellet vil den kolloidale stabiliteten bli bestemt av koronaen til de produserte biomolekylene.31 Fordi denne oppførselen også ble observert i våre aggregeringsmålinger (diskutert mer detaljert senere), kan ikke citratbegrensning alene forklare dette fenomenet.
På den annen side er partikkelstørrelsen omvendt proporsjonal med aggregeringstendensen på nanometernivå.Dette støttes hovedsakelig av den tradisjonelle Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO) metoden, hvor partikkeltiltrekning beskrives som summen av tiltreknings- og frastøtende krefter mellom partikler.I følge He et al., avtar maksimalverdien av DLVO-energikurven med størrelsen på nanopartikler i hematittnanopartikler, noe som gjør det lettere å nå minimum primærenergi, og fremmer derved irreversibel aggregering (kondensering).47 Det spekuleres imidlertid i at det er andre aspekter utover begrensningene til DLVO-teorien.Selv om van der Waals tyngdekraft og elektrostatisk dobbeltlags frastøtning er like med økende partikkelstørrelse, er en anmeldelse av Hotze et al.foreslår at det har en sterkere effekt på aggregering enn DLVO tillater.14 De mener at overflatekrumningen til nanopartikler ikke lenger kan estimeres som en flat overflate, noe som gjør matematisk estimering uanvendelig.I tillegg, når partikkelstørrelsen avtar, blir prosentandelen av atomer som er tilstede på overflaten høyere, noe som fører til elektronisk struktur og overflateladningsadferd.Og overflatereaktivitet endres, noe som kan føre til en reduksjon i ladningen i det elektriske dobbeltlaget og fremme aggregering.
Når vi sammenlignet DLS-resultatene for AgNP-I, AgNP-II og AgNP-III i figur 3, observerte vi at alle tre prøvene viste lignende pH-begrunnelse for aggregering.Et sterkt surt miljø (pH 3) forskyver zetapotensialet til prøven til 0 mV, noe som får partikler til å danne aggregater på mikronstørrelse, mens alkalisk pH skifter zetapotensialet til en større negativ verdi, der partiklene danner mindre aggregater (pH 5 ).Og 7,2) ), eller forbli fullstendig uaggregert (pH 9).Det ble også observert noen viktige forskjeller mellom de ulike prøvene.Gjennom hele forsøket viste AgNP-I seg å være mest følsom for pH-induserte zetapotensialendringer, fordi zetapotensialet til disse partiklene har blitt redusert ved pH 7,2 sammenlignet med pH 9, mens AgNP-II og AgNP-III kun viste A betydelig endring i ζ er rundt pH 3. I tillegg viste AgNP-II langsommere endringer og moderat zetapotensial, mens AgNP-III viste den mildeste oppførselen av de tre, fordi systemet viste den høyeste absolutte zetaverdien og langsom trendbevegelse, noe som indikerer AgNP-III Mest motstandsdyktig mot pH-indusert aggregering.Disse resultatene stemmer overens med de gjennomsnittlige hydrodynamiske diametermålingsresultatene.Med tanke på partikkelstørrelsen til primerne deres, viste AgNP-I konstant gradvis aggregering ved alle pH-verdier, mest sannsynlig på grunn av 10 mM NaCl-bakgrunnen, mens AgNP-II og AgNP-III bare viste signifikant ved pH 3 ved samling.Den mest interessante forskjellen er at til tross for sin store nanopartikkelstørrelse, danner AgNP-III de minste aggregatene ved pH 3 på 24 timer, noe som fremhever dets anti-aggregeringsegenskaper.Ved å dele gjennomsnittlig Z av AgNP ved pH 3 etter 24 timer med verdien av den forberedte prøven, kan det observeres at de relative aggregatstørrelsene til AgNP-I og AgNP-II har økt med 50 ganger, 42 ganger og 22 ganger , henholdsvis.III.
Figur 3 De dynamiske lysspredningsresultatene fra den sitratterminerte sølvnanopartikkelprøven med økende størrelse (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II og 50 nm: AgNP-III) er uttrykt som gjennomsnittlig hydrodynamisk diameter (Z-gjennomsnitt) ) (høyre) Under forskjellige pH-forhold endres zetapotensialet (venstre) innen 24 timer.
Den observerte pH-avhengige aggregeringen påvirket også den karakteristiske overflateplasmonresonansen (SPR) til AgNP-prøvene, som bevist av deres UV-Vis-spektre.I følge tilleggsfigur S1 blir aggregeringen av alle tre sølvnanopartikkelsuspensjoner fulgt av en reduksjon i intensiteten til SPR-toppene deres og et moderat rødt skifte.Omfanget av disse endringene som en funksjon av pH er i samsvar med graden av aggregering forutsagt av DLS-resultatene, men noen interessante trender er observert.I motsetning til intuisjon viser det seg at den mellomstore AgNP-II er mest følsom for SPR-forandringer, mens de to andre prøvene er mindre følsomme.I SPR-forskning er 50 nm den teoretiske partikkelstørrelsesgrensen, som brukes til å skille partikler basert på deres dielektriske egenskaper.Partikler mindre enn 50 nm (AgNP-I og AgNP-II) kan beskrives som enkle dielektriske dipoler, mens partikler som når eller overskrider denne grensen (AgNP-III) har mer komplekse dielektriske egenskaper, og deres resonans. Båndet deler seg i multimodale endringer .Ved to mindre partikkelprøver kan AgNP-er betraktes som enkle dipoler, og plasmaet kan lett overlappe hverandre.Når partikkelstørrelsen øker, produserer denne koblingen i hovedsak et større plasma, noe som kan forklare den høyere følsomheten som er observert.29 For de største partiklene er imidlertid den enkle dipolestimeringen ikke gyldig når andre koblingstilstander også kan forekomme, noe som kan forklare den reduserte tendensen til AgNP-III til å indikere spektrale endringer.29
Under våre eksperimentelle forhold er det bevist at pH-verdien har en dyp effekt på den kolloidale stabiliteten til citratbelagte sølvnanopartikler av forskjellige størrelser.I disse systemene er stabilitet gitt av de negativt ladede -COO-gruppene på overflaten av AgNP.Den karboksylatfunksjonelle gruppen til sitrationet er protonert i et stort antall H+-ioner, slik at den genererte karboksylgruppen ikke lenger kan gi elektrostatisk frastøting mellom partiklene, som vist i den øverste raden i figur 4. I følge Le Chateliers prinsipp, AgNP prøver aggregerer raskt ved pH 3, men blir gradvis mer og mer stabile ettersom pH øker.
Figur 4. Skjematisk mekanisme for overflateinteraksjon definert ved aggregering under forskjellig pH (øverste rad), NaCl-konsentrasjon (midterste rad) og biomolekyler (nederste rad).
I følge figur 5 ble den kolloidale stabiliteten i AgNP-suspensjoner av forskjellige størrelser også undersøkt under økende saltkonsentrasjoner.Basert på zeta-potensialet gir den økte nanopartikkelstørrelsen i disse sitratterminerte AgNP-systemene igjen økt motstand mot ytre påvirkninger fra NaCl.I AgNP-I er 10 mM NaCl tilstrekkelig til å indusere mild aggregering, og en saltkonsentrasjon på 50 mM gir svært like resultater.I AgNP-II og AgNP-III påvirker ikke 10 mM NaCl zeta-potensialet signifikant fordi verdiene deres forblir på (AgNP-II) eller under (AgNP-III) -30 mV.Å øke NaCl-konsentrasjonen til 50 mM og til slutt til 150 mM NaCl er nok til å redusere den absolutte verdien av zeta-potensialet betydelig i alle prøver, selv om større partikler beholder mer negativ ladning.Disse resultatene er i samsvar med den forventede gjennomsnittlige hydrodynamiske diameteren til AgNP;de Z gjennomsnittlige trendlinjene målt på 10, 50 og 150 mM NaCl viser forskjellige, gradvis økende verdier.Til slutt ble aggregater i mikronstørrelse påvist i alle tre 150 mM eksperimentene.
Figur 5 De dynamiske lysspredningsresultatene fra den sitratterminerte sølvnanopartikkelprøven med økende størrelse (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II og 50 nm: AgNP-III) er uttrykt som gjennomsnittlig hydrodynamisk diameter (Z-gjennomsnitt) ) (høyre) og zetapotensial (venstre) endres innen 24 timer under forskjellige NaCl-konsentrasjoner.
UV-Vis-resultatene i tilleggsfigur S2 viser at SPR på 50 og 150 mM NaCl i alle tre prøvene har en øyeblikkelig og signifikant reduksjon.Dette kan forklares med DLS, fordi NaCl-basert aggregering skjer raskere enn pH-avhengige eksperimenter, noe som forklares med den store forskjellen mellom de tidlige (0, 1,5 og 3 timer) målingene.I tillegg vil økning av saltkonsentrasjonen også øke den relative permittiviteten til det eksperimentelle mediet, noe som vil ha en dyp effekt på overflateplasmonresonans.29
Effekten av NaCl er oppsummert i den midterste raden i figur 4. Generelt kan det konkluderes med at økning av konsentrasjonen av natriumklorid har en lignende effekt som å øke surheten, fordi Na+ ioner har en tendens til å koordinere seg rundt karboksylatgruppene, undertrykke negative zeta-potensiale AgNP-er.I tillegg produserte 150 mM NaCl aggregater i mikronstørrelse i alle tre prøvene, noe som indikerer at den fysiologiske elektrolyttkonsentrasjonen er skadelig for den kolloidale stabiliteten til citratterminerte AgNPer.Ved å vurdere den kritiske kondenseringskonsentrasjonen (CCC) av NaCl på lignende AgNP-systemer, kan disse resultatene på en smart måte plasseres i relevant litteratur.Huynh et al.beregnet at CCC for NaCl for citratterminerte sølvnanopartikler med en gjennomsnittlig diameter på 71 nm var 47,6 mM, mens El Badawy et al.observerte at CCC av 10 nm AgNP med sitratbelegg var 70 mM.10,16 I tillegg ble den signifikant høye CCC på ca. 300 mM målt av He et al., noe som førte til at syntesemetoden deres var forskjellig fra den tidligere nevnte publikasjonen.48 Selv om det nåværende bidraget ikke er rettet mot en omfattende analyse av disse verdiene, fordi våre eksperimentelle forhold øker i kompleksiteten til hele studien, synes den biologisk relevante NaCl-konsentrasjonen på 50 mM, spesielt 150 mM NaCl, å være ganske høy.Indusert koagulasjon, forklarer de sterke endringene som er oppdaget.
Det neste trinnet i polymerisasjonseksperimentet er å bruke enkle, men biologisk relevante molekyler for å simulere nanopartikkel-biomolekyl-interaksjoner.Basert på DLS (Figur 6 og 7) og UV-Vis resultater (Supplerende Figur S3 og S4), kan noen generelle konklusjoner hevdes.Under våre eksperimentelle forhold vil de studerte molekylene glukose og glutamin ikke indusere aggregering i noe AgNP-system, fordi Z-middeltrenden er nært knyttet til den tilsvarende referansemåleverdien.Selv om deres tilstedeværelse ikke påvirker aggregering, viser eksperimentelle resultater at disse molekylene er delvis adsorbert på overflaten av AgNP.Det mest fremtredende resultatet som støtter dette synet er den observerte endringen i lysabsorpsjon.Selv om AgNP-I ikke viser meningsfulle bølgelengde- eller intensitetsendringer, kan det observeres tydeligere ved å måle større partikler, noe som mest sannsynlig skyldes den større optiske følsomheten nevnt tidligere.Uavhengig av konsentrasjonen kan glukose forårsake en større rødforskyvning etter 1,5 timer sammenlignet med kontrollmålingen, som er ca. 40 nm i AgNP-II og ca. 10 nm i AgNP-III, noe som beviser forekomsten av overflateinteraksjoner.Glutamin viste en lignende trend, men endringen var ikke så åpenbar.I tillegg er det også verdt å nevne at glutamin kan redusere det absolutte zetapotensialet til mellomstore og store partikler.Men siden disse zeta-endringene ikke ser ut til å påvirke aggregeringsnivået, kan det spekuleres i at selv små biomolekyler som glutamin kan gi en viss grad av romlig frastøting mellom partikler.
Figur 6 De dynamiske lysspredningsresultatene av citratterminerte sølvnanopartikkelprøver med økende størrelse (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II og 50 nm: AgNP-III) er uttrykt som gjennomsnittlig hydrodynamisk diameter (Z-gjennomsnitt) (høyre) Under ytre forhold med forskjellige glukosekonsentrasjoner endres zetapotensialet (venstre) innen 24 timer.
Figur 7 De dynamiske lysspredningsresultatene fra den sitratterminerte sølvnanopartikkelprøven med økende størrelse (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II og 50 nm: AgNP-III) er uttrykt som gjennomsnittlig hydrodynamisk diameter (Z-gjennomsnitt). ) (høyre) I nærvær av glutamin endres zetapotensialet (venstre) innen 24 timer.
Kort sagt, små biomolekyler som glukose og glutamin påvirker ikke kolloidal stabilitet ved den målte konsentrasjonen: selv om de påvirker zetapotensialet og UV-Vis-resultatene i varierende grad, er Z-gjennomsnittsresultatene ikke konsistente.Dette indikerer at overflateadsorpsjonen av molekyler hemmer elektrostatisk frastøtning, men gir samtidig dimensjonsstabilitet.
For å koble de tidligere resultatene med de tidligere resultatene og simulere biologiske forhold mer dyktig, valgte vi noen av de mest brukte cellekulturkomponentene og brukte dem som eksperimentelle forhold for å studere stabiliteten til AgNP-kolloider.I hele in vitro-eksperimentet er en av de viktigste funksjonene til DMEM som medium å etablere de nødvendige osmotiske forholdene, men fra et kjemisk synspunkt er det en kompleks saltløsning med en total ionestyrke tilsvarende 150 mM NaCl .40 Når det gjelder FBS, er det en kompleks blanding av biomolekyler - hovedsakelig proteiner - sett fra overflateadsorpsjonssynspunkt har den noen likheter med de eksperimentelle resultatene av glukose og glutamin, til tross for den kjemiske sammensetningen og mangfoldet Sex er mye mer komplisert.19 DLS og UV-De synlige resultatene vist i henholdsvis figur 8 og tilleggsfigur S5 kan forklares ved å undersøke den kjemiske sammensetningen til disse materialene og korrelere dem med målingene i forrige avsnitt.
Figur 8 De dynamiske lysspredningsresultatene fra den sitratterminerte sølvnanopartikkelprøven med økende størrelse (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II og 50 nm: AgNP-III) er uttrykt som gjennomsnittlig hydrodynamisk diameter (Z-gjennomsnitt). ) (høyre) I nærvær av cellekulturkomponenter DMEM og FBS endres zetapotensialet (venstre) innen 24 timer.
Fortynningen av AgNP-er av forskjellige størrelser i DMEM har en lignende effekt på kolloidal stabilitet som den som er observert i nærvær av høye NaCl-konsentrasjoner.Dispersjonen av AgNP i 50 v/v% DMEM viste at aggregering i stor skala ble oppdaget med økningen av zetapotensialet og Z-gjennomsnittsverdien og den kraftige nedgangen i SPR-intensiteten.Det er verdt å merke seg at den maksimale aggregatstørrelsen indusert av DMEM etter 24 timer er omvendt proporsjonal med størrelsen på primer-nanopartikler.
Samspillet mellom FBS og AgNP er likt det som observeres i nærvær av mindre molekyler som glukose og glutamin, men effekten er sterkere.Z-gjennomsnittet av partiklene forblir upåvirket, mens en økning i zetapotensialet oppdages.SPR-toppen viste en liten rødforskyvning, men kanskje mer interessant at SPR-intensiteten ikke avtok like signifikant som i kontrollmålingen.Disse resultatene kan forklares med den medfødte adsorpsjonen av makromolekyler på overflaten av nanopartikler (nederste rad i figur 4), som nå forstås som dannelsen av biomolekylær korona i kroppen.49