Javascript jest aktualnie wyłączony w Twojej przeglądarce.Gdy JavaScript jest wyłączony, niektóre funkcje tej witryny nie będą działać.
Zarejestruj swoje szczegółowe dane i konkretne leki, które Cię interesują, a my dopasujemy podane przez Ciebie informacje do artykułów w naszej obszernej bazie danych i prześlemy Ci kopię w formacie PDF e-mailem w odpowiednim czasie.
Czy mniejsze nanocząstki zawsze są lepsze?Zrozumienie biologicznych skutków zależnej od wielkości agregacji nanocząstek srebra w biologicznie istotnych warunkach
Autorzy: Bélteky P, Rónavári A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Kónya Z
Péter Bélteky,1,* Andrea Rónavári,1,* Dalma Zakupszky,1 Eszter Boka,1 Nóra Igaz,2 Bettina Szerencsés,3 Ilona Pfeiffer,3 Csaba Vágvölgyi,3 Mónika Kiricsi z Chemii Środowiska, Węgry, Węgry Wydział Nauk Naukowych i Informatyki , Uniwersytet w Szeged;2 Katedra Biochemii i Biologii Molekularnej, Wydział Nauki i Informacji, Uniwersytet w Szeged, Węgry;3 Katedra Mikrobiologii, Wydział Nauki i Informacji, Uniwersytet w Szeged, Węgry;4MTA-SZTE Grupa Badawcza ds. Kinetyki Reakcji i Chemii Powierzchni, Szeged, Węgry* Autorzy ci w równym stopniu przyczynili się do powstania tej pracy.Komunikacja: Zoltán Kónya Wydział Chemii Stosowanej i Środowiskowej, Wydział Nauk Naukowych i Informatyki, Uniwersytet w Szeged, Rerrich Square 1, Szeged, H-6720, Węgry Telefon +36 62 544620 E-mail [Ochrona poczty elektronicznej] Cel: Nanocząsteczki srebra (AgNP) są jeden z najczęściej badanych nanomateriałów, szczególnie ze względu na ich zastosowania biomedyczne.Jednak ze względu na agregację nanocząstek ich doskonała cytotoksyczność i działanie przeciwbakteryjne są często zagrożone w mediach biologicznych.W tej pracy zbadano zachowanie agregacyjne i powiązane aktywności biologiczne trzech różnych próbek nanocząstek srebra zakończonych cytrynianem o średniej średnicy 10, 20 i 50 nm.Metoda: Wykorzystanie transmisyjnego mikroskopu elektronowego do syntezy i charakteryzacji nanocząstek, ocena ich zachowania agregacyjnego przy różnych wartościach pH, ​​stężeniach NaCl, glukozy i glutaminy metodą dynamicznego rozpraszania światła i spektroskopii w zakresie ultrafioletu widzialnego.Ponadto składniki pożywki do hodowli komórkowej, takie jak Dulbecco, poprawiają zachowanie agregacyjne w pożywce Eagle i płodowej surowicy cielęcej.Wyniki: Wyniki pokazują, że kwaśne pH i fizjologiczna zawartość elektrolitów na ogół powodują agregację w skali mikronowej, w czym może pośredniczyć tworzenie korony biomolekularnej.Warto zaznaczyć, że większe cząstki wykazują większą odporność na wpływy zewnętrzne niż ich mniejsze odpowiedniki.Przeprowadzono testy cytotoksyczności i antybakteryjności in vitro, traktując komórki agregatami nanocząstek na różnych etapach agregacji.Wniosek: Nasze wyniki ujawniają głęboką korelację między stabilnością koloidalną a toksycznością AgNP, ponieważ ekstremalna agregacja prowadzi do całkowitej utraty aktywności biologicznej.Wyższy stopień przeciwdziałania agregacji obserwowany w przypadku większych cząstek ma znaczący wpływ na toksyczność in vitro, ponieważ takie próbki zachowują większą aktywność przeciwdrobnoustrojową i komórkową ssaków.Odkrycia te prowadzą do wniosku, że pomimo ogólnej opinii zawartej w odpowiedniej literaturze, ukierunkowanie na możliwie najmniejsze nanocząstki może nie być najlepszym sposobem działania.Słowa kluczowe: wzrost za pośrednictwem nasion, stabilność koloidalna, zachowanie agregacyjne zależne od wielkości, toksyczność uszkodzeń agregacyjnych
W miarę ciągłego wzrostu zapotrzebowania i produkcji nanomateriałów coraz większą uwagę zwraca się na ich bezpieczeństwo biologiczne lub aktywność biologiczną.Nanocząstki srebra (AgNP) są jednymi z najczęściej syntetyzowanych, badanych i wykorzystywanych przedstawicieli tej klasy materiałów ze względu na ich doskonałe właściwości katalityczne, optyczne i biologiczne.1 Powszechnie uważa się, że unikalne cechy nanomateriałów (w tym AgNP) wynikają głównie z ich dużej powierzchni właściwej.Dlatego nieuchronnym problemem jest każdy proces, który wpływa na tę kluczową cechę, taką jak wielkość cząstek, powłoka powierzchniowa lub agregacja, niezależnie od tego, czy poważnie uszkodzi to właściwości nanocząstek, które są krytyczne dla określonych zastosowań.
Tematyka wpływu wielkości cząstek i stabilizatorów została stosunkowo dobrze udokumentowana w literaturze.Na przykład ogólnie przyjęty pogląd jest taki, że mniejsze nanocząstki są bardziej toksyczne niż większe nanocząstki.2 Zgodnie z literaturą ogólną, nasze poprzednie badania wykazały zależną od wielkości aktywność nanosrebra na komórkach i mikroorganizmach ssaków.3–5 Powłoka powierzchniowa to kolejna cecha mająca szeroki wpływ na właściwości nanomateriałów.Samo dodanie lub modyfikacja stabilizatorów na powierzchni powoduje, że ten sam nanomateriał może mieć zupełnie inne właściwości fizyczne, chemiczne i biologiczne.Nakładanie środków zamykających najczęściej odbywa się w ramach syntezy nanocząstek.Na przykład nanocząstki srebra zakończone cytrynianem są jednymi z najważniejszych AgNP w badaniach, które syntetyzuje się poprzez redukcję soli srebra w wybranym roztworze stabilizatora jako medium reakcyjnym.6 Cytrynian może z łatwością wykorzystać swój niski koszt, dostępność, biokompatybilność i silne powinowactwo do srebra, co może znaleźć odzwierciedlenie w różnych proponowanych interakcjach, od odwracalnej adsorpcji powierzchniowej po interakcje jonowe.Małe cząsteczki i jony wieloatomowe w pobliżu 7,8, takie jak cytryniany, polimery, polielektrolity i czynniki biologiczne są również powszechnie stosowane do stabilizacji nanosrebra i przeprowadzania na nim unikalnych funkcjonalizacji.9-12
Chociaż możliwość zmiany aktywności nanocząstek poprzez celowe przykrycie powierzchni jest bardzo interesującym obszarem, główna rola tej powłoki powierzchniowej jest znikoma, zapewniając stabilność koloidalną układu nanocząstek.Duża powierzchnia właściwa nanomateriałów będzie wytwarzać dużą energię powierzchniową, co utrudnia termodynamiczną zdolność układu do osiągnięcia minimalnej energii.13 Bez odpowiedniej stabilizacji może to prowadzić do aglomeracji nanomateriałów.Agregacja to tworzenie agregatów cząstek o różnych kształtach i rozmiarach, które ma miejsce, gdy rozproszone cząstki spotykają się, a obecne interakcje termodynamiczne umożliwiają cząstkom przyleganie do siebie.Dlatego stosuje się stabilizatory, które zapobiegają agregacji, wprowadzając pomiędzy cząstkami wystarczająco dużą siłę odpychania, aby przeciwdziałać ich przyciąganiu termodynamicznemu.14
Chociaż temat wielkości cząstek i pokrycia powierzchni został dokładnie zbadany w kontekście regulacji aktywności biologicznej wywoływanej przez nanocząstki, agregacja cząstek jest obszarem w dużej mierze zaniedbywanym.Prawie nie ma dokładnych badań pozwalających określić stabilność koloidalną nanocząstek w biologicznie istotnych warunkach.10,15-17 Ponadto wkład ten jest szczególnie rzadki, gdy badano również toksyczność związaną z agregacją, nawet jeśli może to powodować reakcje niepożądane, takie jak zakrzepica naczyń lub utratę pożądanych cech, takich jak toksyczność, jak pokazano na rysunku 1.18, pokazano 19.W rzeczywistości jeden z niewielu znanych mechanizmów oporności nanocząstek srebra jest związany z agregacją, ponieważ według doniesień niektóre szczepy E. coli i Pseudomonas aeruginosa zmniejszają swoją wrażliwość na nanosrebro poprzez ekspresję białka flageliny, flageliny.Ma duże powinowactwo do srebra, powodując w ten sposób agregację.20
Istnieje kilka różnych mechanizmów związanych z toksycznością nanocząstek srebra, a agregacja wpływa na wszystkie te mechanizmy.Najbardziej dyskutowana metoda aktywności biologicznej AgNP, czasami nazywana mechanizmem „konia trojańskiego”, traktuje AgNP jako nośniki Ag+.1,21 Mechanizm konia trojańskiego może zapewnić duży wzrost lokalnego stężenia Ag+, co prowadzi do generacji RFT i depolaryzacji błony.22-24 Agregacja może wpływać na uwalnianie Ag+, wpływając w ten sposób na toksyczność, ponieważ zmniejsza efektywną powierzchnię aktywną, na której jony srebra mogą zostać utlenione i rozpuszczone.Jednakże AgNP będą wykazywać toksyczność nie tylko poprzez uwalnianie jonów.Należy wziąć pod uwagę wiele interakcji związanych z rozmiarem i morfologią.Wśród nich cechy definiujące to rozmiar i kształt powierzchni nanocząstek.4,25 Zbiór tych mechanizmów można sklasyfikować jako „mechanizmy toksyczności indukowanej”.Istnieje potencjalnie wiele reakcji mitochondrialnych i błon powierzchniowych, które mogą uszkadzać organelle i powodować śmierć komórki.25-27 Ponieważ tworzenie agregatów w naturalny sposób wpływa na wielkość i kształt obiektów zawierających srebro rozpoznawanych przez żywe systemy, interakcje te mogą również mieć wpływ.
W naszej poprzedniej pracy na temat agregacji nanocząstek srebra zademonstrowaliśmy skuteczną procedurę przesiewową składającą się z eksperymentów chemicznych i biologicznych in vitro w celu zbadania tego problemu.19 Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) jest preferowaną techniką w tego typu inspekcjach, ponieważ materiał może rozpraszać fotony na długości fali porównywalnej z rozmiarem jego cząstek.Ponieważ prędkość ruchu Browna cząstek w ciekłym ośrodku jest powiązana z ich rozmiarem, zmianę natężenia rozproszonego światła można wykorzystać do określenia średniej średnicy hydrodynamicznej (średniej Z) próbki cieczy.28 Dodatkowo, przykładając napięcie do próbki, potencjał zeta (potencjał ζ) nanocząstki można zmierzyć podobnie jak średnia wartość Z.13,28 Jeśli wartość bezwzględna potencjału zeta będzie wystarczająco wysoka (zgodnie z ogólnymi wytycznymi> ±30 mV), nastąpi silne odpychanie elektrostatyczne pomiędzy cząstkami, aby przeciwdziałać agregacji.Charakterystyczny powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) jest unikalnym zjawiskiem optycznym, przypisywanym głównie nanocząstkom metali szlachetnych (głównie Au i Ag).29​​ Na podstawie oscylacji elektronowych (plazmonów powierzchniowych) tych materiałów w nanoskali wiadomo, że sferyczne AgNP mają charakterystyczny pik absorpcji UV-Vis w pobliżu 400 nm.30 Intensywność i przesunięcie długości fali cząstek uzupełniają wyniki DLS, ponieważ metodę tę można zastosować do wykrywania agregacji nanocząstek i adsorpcji powierzchniowej biomolekuł.
Na podstawie uzyskanych informacji przeprowadza się testy żywotności komórek (MTT) i badania antybakteryjne w taki sposób, że toksyczność AgNP opisuje się jako funkcję poziomu agregacji, a nie (najczęściej stosowanego czynnika) stężenia nanocząstek.Ta unikalna metoda pozwala nam wykazać ogromne znaczenie poziomu agregacji w aktywności biologicznej, ponieważ na przykład AgNP zakończone cytrynianem całkowicie tracą swoją aktywność biologiczną w ciągu kilku godzin z powodu agregacji.19
W bieżących pracach naszym celem jest znaczne poszerzenie naszego wcześniejszego wkładu w stabilność koloidów pochodzenia biologicznego i ich wpływ na aktywność biologiczną poprzez badanie wpływu wielkości nanocząstek na agregację nanocząstek.Jest to niewątpliwie jedno z badań nad nanocząsteczkami.Aby zbadać tę kwestię, zastosowano metodę wzrostu za pośrednictwem nasion w celu wytworzenia zakończonych cytrynianem AgNP w trzech różnych zakresach wielkości (10, 20 i 50 nm).6,32 jako jedna z najpowszechniejszych metod.W przypadku nanomateriałów, które są szeroko i rutynowo stosowane w zastosowaniach medycznych, wybiera się zakończone cytrynianem AgNP o różnych rozmiarach w celu zbadania możliwej zależności wielkości biologicznych właściwości nanosrebra związanych z agregacją.Po zsyntetyzowaniu AgNP o różnych rozmiarach scharakteryzowaliśmy powstałe próbki za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), a następnie zbadaliśmy cząstki, stosując wspomnianą procedurę przesiewową.Ponadto w obecności hodowli komórkowych in vitro na podłożu modyfikowanym Eagle'a Dulbecco (DMEM) i płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oceniano zależne od wielkości zachowanie agregacji i jego zachowanie przy różnych wartościach pH, ​​stężeniach NaCl, glukozy i glutaminy.Charakterystykę cytotoksyczności określa się w kompleksowych warunkach.Konsensus naukowy wskazuje, że ogólnie preferowane są mniejsze cząstki;nasze badanie zapewnia platformę chemiczną i biologiczną do ustalenia, czy rzeczywiście tak jest.
Trzy nanocząstki srebra o różnych zakresach wielkości przygotowano metodą wzrostu za pośrednictwem nasion zaproponowaną przez Wana i in., z niewielkimi dostosowaniami.6 Metoda ta opiera się na redukcji chemicznej z wykorzystaniem azotanu srebra (AgNO3) jako źródła srebra, borowodorku sodu (NaBH4) jako środka redukującego i cytrynianu sodu jako stabilizatora.Najpierw przygotuj 75 ml 9 mM wodnego roztworu cytrynianu z dwuwodzianu cytrynianu sodu (Na3C6H5O7 x 2H2O) i ogrzej do 70°C.Następnie do środowiska reakcyjnego dodano 2 ml 1% w/v roztworu AgNO3, a następnie do mieszaniny wkroplono świeżo przygotowany roztwór borowodorku sodu (2 ml 0,1% w/v).Powstałą żółtobrązową zawiesinę utrzymywano w temperaturze 70°C przy energicznym mieszaniu przez 1 godzinę, a następnie ochłodzono do temperatury pokojowej.Powstała próbka (odtąd nazywana AgNP-I) służy jako podstawa wzrostu za pośrednictwem nasion w następnym etapie syntezy.
Aby zsyntetyzować zawiesinę cząstek średniej wielkości (oznaczoną jako AgNP-II), podgrzej 90 mL 7,6 mM roztworu cytrynianu do 80°C, wymieszaj go z 10 mL AgNP-I, a następnie wymieszaj 2 mL 1% w/v roztworu AgNO3 utrzymywano przy energicznym mieszaniu mechanicznym przez 1 godzinę, a następnie próbkę ochłodzono do temperatury pokojowej.
W przypadku największej cząstki (AgNP-III) powtórz ten sam proces wzrostu, ale w tym przypadku użyj 10 mL AgNP-II jako zawiesiny nasion.Po osiągnięciu przez próbki temperatury pokojowej, ustala się ich nominalne stężenie Ag w oparciu o całkowitą zawartość AgNO3 na 150 ppm poprzez dodanie lub odparowanie dodatkowego rozpuszczalnika w temperaturze 40°C i na koniec przechowuje je w temperaturze 4°C do dalszego użycia.
Użyj transmisyjnego mikroskopu elektronowego FEI Tecnai G2 20 X-Twin (TEM) (siedziba główna FEI, Hillsboro, Oregon, USA) z napięciem przyspieszającym 200 kV, aby zbadać cechy morfologiczne nanocząstek i uchwycić ich wzór dyfrakcji elektronów (ED).Co najmniej 15 reprezentatywnych obrazów (~750 cząstek) oceniono przy użyciu pakietu oprogramowania ImageJ, a powstałe histogramy (i wszystkie wykresy w całym badaniu) utworzono w OriginPro 2018 (OriginLab, Northampton, MA, USA) 33, 34.
Zmierzono średnią średnicę hydrodynamiczną (średnia Z), potencjał zeta (potencjał ζ) i charakterystyczny powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) próbek w celu zilustrowania ich początkowych właściwości koloidalnych.Średnią średnicę hydrodynamiczną i potencjał zeta próbki zmierzono za pomocą instrumentu Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, Wielka Brytania) przy użyciu jednorazowych złożonych komórek kapilarnych w temperaturze 37 ± 0,1°C.Do uzyskania charakterystycznych charakterystyk SPR z widm absorpcji UV-Vis próbek w zakresie 250-800 nm wykorzystano spektrofotometr Ocean Optics 355 DH-2000-BAL UV-Vis (Halma PLC, Largo, FL, USA).
W trakcie całego eksperymentu przeprowadzono jednocześnie trzy różne typy pomiarów związanych ze stabilnością koloidalną.Użyj DLS do pomiaru średniej średnicy hydrodynamicznej (średnia Z) i potencjału zeta (potencjał ζ) cząstek, ponieważ średnia Z jest powiązana ze średnią wielkością agregatów nanocząstek, a potencjał zeta wskazuje, czy odpychanie elektrostatyczne w układzie jest wystarczająco silny, aby zrównoważyć przyciąganie Van der Waalsa pomiędzy nanocząstkami.Pomiary przeprowadza się trzykrotnie, a odchylenie standardowe średniej Z i potencjału zeta oblicza się za pomocą oprogramowania Zetasizer.Charakterystyczne widma SPR cząstek ocenia się za pomocą spektroskopii UV-Vis, ponieważ zmiany intensywności piku i długości fali mogą wskazywać na agregację i interakcje powierzchniowe.29,35 W rzeczywistości powierzchniowy rezonans plazmonowy w metalach szlachetnych ma tak duży wpływ, że doprowadził do nowych metod analizy biomolekuł.29,36,37 Stężenie AgNPs w mieszaninie doświadczalnej wynosi około 10 ppm, a celem jest ustalenie intensywności maksymalnej początkowej absorpcji SPR na 1. Doświadczenie przeprowadzono w sposób zależny od czasu przy 0;1,5;3;6;12 i 24 godziny w różnych biologicznie istotnych warunkach.Więcej szczegółów opisujących eksperyment można znaleźć w naszej poprzedniej pracy.19 Krótko mówiąc, różne wartości pH (3; 5; 7,2 i 9), różne stężenia chlorku sodu (10 mM; 50 mM; 150 mM), glukozy (3,9 mM; 6,7 mM) i glutaminy (4 mM) oraz przygotowali także zmodyfikowaną pożywkę Eagle'a (DMEM) i płodową surowicę bydlęcą (FBS) (w wodzie i DMEM) firmy Dulbecco jako układy modelowe i zbadali ich wpływ na zachowanie agregacyjne syntetyzowanych nanocząstek srebra.pH Wartości NaCl, glukozy i glutaminy ocenia się na podstawie stężeń fizjologicznych, natomiast ilości DMEM i FBS są takie same jak poziomy stosowane w całym eksperymencie in vitro.38-42 Wszystkie pomiary przeprowadzono przy pH 7,2 i 37°C przy stałym stężeniu soli tła wynoszącym 10 mM NaCl, aby wyeliminować wszelkie interakcje cząstek na duże odległości (z wyjątkiem pewnych eksperymentów związanych z pH i NaCl, gdzie te atrybuty są zmiennymi w ramach badanie).28 Listę różnych warunków podsumowano w Tabeli 1. Doświadczenie oznaczone † służy jako odniesienie i odpowiada próbce zawierającej 10 mM NaCl i pH 7,2.
Linię komórkową ludzkiego raka prostaty (DU145) i unieśmiertelnione ludzkie keratynocyty (HaCaT) uzyskano z ATCC (Manassas, VA, USA).Komórki rutynowo hoduje się w minimalnej niezbędnej pożywce Dulbecco Eagle (DMEM) zawierającej 4,5 g/l glukozy (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), uzupełnionej 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 0,01% streptomycyny i 0,005% Penicylina (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA).Komórki hoduje się w inkubatorze w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO2 i 95% wilgotności.
W celu zbadania zmian cytotoksyczności AgNP spowodowanych agregacją cząstek w sposób zależny od czasu przeprowadzono dwuetapowy test MTT.Najpierw zmierzono żywotność dwóch typów komórek po traktowaniu AgNP-I, AgNP-II i AgNP-III.W tym celu oba typy komórek wysiano na 96-dołkowe płytki przy gęstości 10 000 komórek/dołek i drugiego dnia traktowano nanocząsteczkami srebra o trzech różnych rozmiarach we wzrastających stężeniach.Po 24 godzinach traktowania komórki przemyto PBS i inkubowano z 0,5 mg/ml odczynnika MTT (SERVA, Heidelberg, Niemcy) rozcieńczonym w pożywce hodowlanej przez 1 godzinę w temperaturze 37°C.Kryształy formazanu rozpuszczono w DMSO (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) i zmierzono absorpcję przy 570 nm przy użyciu czytnika płytek Synergy HTX (BioTek-Węgry, Budapeszt, Węgry).Wartość absorpcji nietraktowanej próbki kontrolnej uważa się za 100% współczynnika przeżycia.Wykonaj co najmniej 3 eksperymenty, korzystając z czterech niezależnych replik biologicznych.IC50 oblicza się z krzywej odpowiedzi na dawkę w oparciu o wyniki żywotności.
Następnie w drugim etapie, poprzez inkubację cząstek ze 150 mM NaCl przez różne okresy czasu (0, 1,5, 3, 6, 12 i 24 godziny) przed traktowaniem komórek, uzyskano różne stany agregacji nanocząstek srebra.Następnie przeprowadzono ten sam test MTT, jak opisano wcześniej, aby ocenić zmiany w żywotności komórek, na które wpływa agregacja cząstek.Użyj GraphPad Prism 7 do oceny wyniku końcowego, oblicz istotność statystyczną eksperymentu za pomocą testu t dla niesparowanych i oznacz jego poziom jako * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01), *** (p ≤ 0,001 ) I **** (p ≤ 0,0001).
Do badania wrażliwości przeciwbakteryjnej na Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM; Research Center for Pathogenic Fungi and Microbial Toxicology, Chiba University) i Bacillus Test megaterium SZMC 6031 wykorzystano trzy różne rozmiary nanocząstek srebra (AgNP-I, AgNP-II i AgNP-III). (SZMC: Szeged Microbiology Collection) i E. coli SZMC 0582 w podłożu RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Co.).Aby ocenić zmiany aktywności przeciwbakteryjnej spowodowane agregacją cząstek, w pierwszej kolejności oznaczono ich minimalne stężenie hamujące (MIC) poprzez mikrorozcieńczenia w 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania.Do 50 µl standaryzowanej zawiesiny komórek (5 × 104 komórek/ml w pożywce RPMI 1640) dodać 50 µl zawiesiny nanocząstek srebra i seryjnie rozcieńczyć dwukrotnie w stosunku do stężenia (w ww. pożywce zakres wynosi od 0 do 75 ppm, tj. próbka kontrolna zawiera 50 µl zawiesiny komórek i 50 µl pożywki bez nanocząstek).Następnie płytkę inkubowano w temperaturze 30°C przez 48 godzin i mierzono gęstość optyczną hodowli przy 620 nm przy użyciu czytnika płytek SPECTROstar Nano (BMG LabTech, Offenburg, Niemcy).Doświadczenie przeprowadzono trzykrotnie w trzech powtórzeniach.
Z wyjątkiem tego, że w tym czasie użyto 50 µl pojedynczych zagregowanych próbek nanocząstek, tę samą procedurę, którą opisano wcześniej, zastosowano do zbadania wpływu agregacji na aktywność przeciwbakteryjną na wyżej wymienionych szczepach.Różne stany agregacji nanocząstek srebra uzyskuje się poprzez inkubację cząstek ze 150 mM NaCl przez różne okresy czasu (0, 1,5, 3, 6, 12 i 24 godziny) przed obróbką komórek.Jako kontrolę wzrostu zastosowano zawiesinę uzupełnioną 50 µl pożywki RPMI 1640, natomiast w celu kontroli toksyczności zastosowano zawiesinę niezagregowanych nanocząstek.Doświadczenie przeprowadzono trzykrotnie w trzech powtórzeniach.Użyj GraphPad Prism 7, aby ponownie ocenić wynik końcowy, korzystając z tej samej analizy statystycznej, co analiza MTT.
Scharakteryzowano poziom agregacji najmniejszych cząstek (AgNP-I), a wyniki częściowo opublikowano w naszej poprzedniej pracy, jednak dla lepszego porównania wszystkie cząstki zostały dokładnie przesiane.Dane eksperymentalne zebrano i omówiono w kolejnych sekcjach.Trzy rozmiary AgNP.19
Pomiary wykonane za pomocą TEM, UV-Vis i DLS potwierdziły pomyślną syntezę wszystkich próbek AgNP (ryc. 2A-D).Zgodnie z pierwszym rzędem na ryc. 2 najmniejsza cząstka (AgNP-I) wykazuje jednolitą morfologię kulistą o średniej średnicy około 10 nm.Metoda wzrostu za pośrednictwem nasion zapewnia również AgNP-II i AgNP-III o różnych zakresach wielkości ze średnią średnicą cząstek odpowiednio około 20 nm i 50 nm.Zgodnie ze standardowym odchyleniem rozkładu cząstek rozmiary trzech próbek nie pokrywają się, co jest ważne dla ich analizy porównawczej.Porównując średni współczynnik kształtu i współczynnik grubości projekcji cząstek 2D w oparciu o TEM, zakłada się, że kulistość cząstek jest oceniana przez wtyczkę filtra kształtu ImageJ (rysunek 2E).43 Z analizy kształtu cząstek wynika, że ​​wzrost cząstek nie ma wpływu na ich współczynnik kształtu (duży bok/krótszy bok najmniejszego prostokąta ograniczającego), a na ich współczynnik cienkości (zmierzona powierzchnia odpowiedniego idealnego koła/obszar teoretyczny ) stopniowo maleje.Powoduje to powstawanie coraz większej liczby cząstek wielościennych, które w teorii są idealnie okrągłe, co odpowiada współczynnikowi cienkości wynoszącemu 1.
Rycina 2 Obraz z transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) (A), wzór dyfrakcji elektronów (ED) (B), histogram rozkładu wielkości (C), charakterystyczne widmo absorpcji światła ultrafioletowego (UV-Vis) (D) i średni cytrynian płynu -zakończone nanocząstki srebra o średnicy mechanicznej (średnia Z), potencjale zeta, współczynniku kształtu i współczynniku grubości (E) mają trzy różne zakresy wielkości: AgNP-I wynosi 10 nm (górny rząd), AgNP -II wynosi 20 nm (środkowy rząd ), AgNP-III (dolny rząd) wynosi 50 nm.
Chociaż cykliczny charakter metody wzrostu w pewnym stopniu wpłynął na kształt cząstek, powodując mniejszą kulistość większych AgNP, wszystkie trzy próbki pozostały quasi-sferyczne.Ponadto, jak pokazano na obrazie dyfrakcji elektronów na rysunku 2B, nano Nie ma to wpływu na krystaliczność cząstek.Wyraźny pierścień dyfrakcyjny – który można skorelować ze wskaźnikami Millera (111), (220), (200) i (311) Millera – jest bardzo zgodny z literaturą naukową i naszymi wcześniejszymi wkładami.9, 19,44 Fragmentacja pierścienia Debye’a-Scherrera AgNP-II i AgNP-III wynika z faktu, że obraz ED jest rejestrowany przy tym samym powiększeniu, zatem wraz ze wzrostem wielkości cząstek liczba ugiętych cząstek na powierzchnia jednostki rośnie i maleje.
Wiadomo, że rozmiar i kształt nanocząstek wpływają na aktywność biologiczną.3,45 Zależną od kształtu aktywność katalityczną i biologiczną można wytłumaczyć faktem, że różne kształty mają tendencję do proliferacji pewnych ścian kryształów (o różnych wskaźnikach Millera), a te ściany kryształów mają różną aktywność.45,46 Ponieważ przygotowane cząstki dają podobne wyniki ED odpowiadające bardzo podobnym właściwościom kryształów, można założyć, że w naszych kolejnych eksperymentach dotyczących stabilności koloidalnej i aktywności biologicznej wszelkie zaobserwowane różnice należy przypisać wielkości nanocząstek, a nie właściwościom związanym z kształtem.
Wyniki UV-Vis podsumowane na rysunku 2D dodatkowo podkreślają przeważającą sferyczną naturę zsyntetyzowanego AgNP, ponieważ piki SPR wszystkich trzech próbek wynoszą około 400 nm, co jest charakterystyczną wartością sferycznych nanocząstek srebra.29,30 Przechwycone widma potwierdziły również pomyślny wzrost nanosrebra za pośrednictwem nasion.Wraz ze wzrostem wielkości cząstek długość fali odpowiadająca maksymalnej absorpcji światła przez AgNP-II – co jest bardziej widoczne – Według literatury, AgNP-III doświadczyło przesunięcia ku czerwieni.6,29
Jeśli chodzi o początkową stabilność koloidalną układu AgNP, do pomiaru średniej średnicy hydrodynamicznej i potencjału zeta cząstek przy pH 7,2 zastosowano DLS.Wyniki przedstawione na rysunku 2E pokazują, że AgNP-III ma wyższą stabilność koloidalną niż AgNP-I lub AgNP-II, ponieważ wspólne wytyczne wskazują, że do długoterminowej stabilności koloidalnej niezbędny jest bezwzględny potencjał zeta wynoszący 30 mV. Odkrycie to zostało dodatkowo potwierdzone, gdy średnią wartość Z (otrzymaną jako średnia średnica hydrodynamiczna cząstek swobodnych i zagregowanych) porównuje się z pierwotnym rozmiarem cząstek uzyskanym za pomocą TEM, ponieważ im bliżej są te dwie wartości, tym łagodniejszy jest stopień zebrania w próbce.W rzeczywistości średnia Z AgNP-I i AgNP-II jest rozsądnie wyższa niż ich główna wielkość cząstek oszacowana w TEM, zatem w porównaniu z AgNP-III przewiduje się, że próbki te będą bardziej podatne na agregację, gdzie wysoce ujemny potencjał zeta towarzyszy zbliżony rozmiar Średnia wartość Z.
Wyjaśnienie tego zjawiska może być dwojakie.Z jednej strony stężenie cytrynianu utrzymuje się na podobnym poziomie we wszystkich etapach syntezy, zapewniając stosunkowo dużą ilość naładowanych grup powierzchniowych, aby zapobiec zmniejszaniu się powierzchni właściwej rosnących cząstek.Jednakże według Levaka i wsp. małe cząsteczki, takie jak cytrynian, można łatwo wymienić na biocząsteczki na powierzchni nanocząstek.W tym przypadku stabilność koloidalna będzie określona przez koronę wytworzonych biomolekuł.31 Ponieważ takie zachowanie zaobserwowano również w naszych pomiarach agregacji (omówionych bardziej szczegółowo później), samo ograniczenie cytrynianu nie może wyjaśnić tego zjawiska.
Z drugiej strony wielkość cząstek jest odwrotnie proporcjonalna do tendencji do agregacji na poziomie nanometrowym.Potwierdza to głównie tradycyjna metoda Derjaguina-Landau-Verweya-Overbeeka (DLVO), w której przyciąganie cząstek opisuje się jako sumę sił przyciągania i odpychania pomiędzy cząstkami.Według He i wsp. maksymalna wartość krzywej energii DLVO maleje wraz z wielkością nanocząstek w nanocząsteczkach hematytu, ułatwiając osiągnięcie minimalnej energii pierwotnej, sprzyjając w ten sposób nieodwracalnej agregacji (kondensacji).47 Spekuluje się jednak, że istnieją inne aspekty wykraczające poza ograniczenia teorii DLVO.Chociaż grawitacja van der Waalsa i elektrostatyczne odpychanie dwuwarstwowe są podobne wraz ze wzrostem wielkości cząstek, przegląd przeprowadzony przez Hotze i in.proponuje, że ma to silniejszy wpływ na agregację, niż pozwala na to DLVO.14 Uważają, że krzywizny powierzchni nanocząstek nie można już oszacować jako płaskiej powierzchni, co sprawia, że ​​szacunki matematyczne nie mają zastosowania.Ponadto, gdy wielkość cząstek maleje, procent atomów obecnych na powierzchni wzrasta, co prowadzi do struktury elektronowej i zachowania ładunku powierzchniowego.Oraz zmiany reaktywności powierzchni, które mogą prowadzić do zmniejszenia ładunku w podwójnej warstwie elektrycznej i sprzyjać agregacji.
Porównując wyniki DLS dla AgNP-I, AgNP-II i AgNP-III na Figurze 3, zaobserwowaliśmy, że wszystkie trzy próbki wykazywały podobne pH powodujące agregację.Silnie kwaśne środowisko (pH 3) przesuwa potencjał zeta próbki do 0 mV, powodując, że cząstki tworzą agregaty o wielkości mikrona, podczas gdy zasadowe pH przesuwa potencjał zeta do większej wartości ujemnej, gdzie cząstki tworzą mniejsze agregaty (pH 5 ).I 7.2) ) lub pozostać całkowicie niezagregowane (pH 9).Zaobserwowano także pewne istotne różnice pomiędzy różnymi próbkami.W całym eksperymencie AgNP-I okazał się najbardziej wrażliwy na zmiany potencjału zeta wywołane pH, ponieważ potencjał zeta tych cząstek został obniżony przy pH 7,2 w porównaniu do pH 9, podczas gdy AgNP-II i AgNP-III wykazywały jedynie A znaczna zmiana ζ wynosi około pH 3. Ponadto AgNP-II wykazywał wolniejsze zmiany i umiarkowany potencjał zeta, podczas gdy AgNP-III zachowywał się najłagodniej ze wszystkich trzech, ponieważ system wykazywał najwyższą bezwzględną wartość zeta i powolny ruch trendu, co wskazuje AgNP-III Najbardziej odporny na agregację wywołaną pH.Wyniki te są zgodne z wynikami pomiarów średniej średnicy hydrodynamicznej.Biorąc pod uwagę wielkość cząstek ich starterów, AgNP-I wykazywał stałą, stopniową agregację przy wszystkich wartościach pH, ​​najprawdopodobniej z powodu tła 10 mM NaCl, podczas gdy AgNP-II i AgNP-III wykazywały znaczącą dopiero przy pH gromadzenia 3.Najciekawsza różnica polega na tym, że pomimo dużego rozmiaru nanocząstek AgNP-III tworzy najmniejsze agregaty przy pH 3 w ciągu 24 godzin, co podkreśla jego właściwości przeciwagregacyjne.Dzieląc średnią Z AgNPs przy pH 3 po 24 godzinach przez wartość przygotowanej próbki, można zaobserwować, że względne rozmiary agregatów AgNP-I i AgNP-II wzrosły 50-krotnie, 42-krotnie i 22-krotnie odpowiednio.III.
Rysunek 3 Wyniki dynamicznego rozpraszania światła próbki nanocząstek srebra zakończonych cytrynianem o wzrastającym rozmiarze (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II i 50 nm: AgNP-III) wyrażono jako średnią średnicę hydrodynamiczną (średnia Z ) (po prawej) W różnych warunkach pH potencjał zeta (po lewej) zmienia się w ciągu 24 godzin.
Zaobserwowana agregacja zależna od pH wpłynęła również na charakterystyczny powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) próbek AgNP, o czym świadczą ich widma UV-Vis.Zgodnie z rysunkiem uzupełniającym S1, po agregacji wszystkich trzech zawiesin nanocząstek srebra następuje zmniejszenie intensywności ich pików SPR i umiarkowane przesunięcie ku czerwieni.Stopień tych zmian w funkcji pH jest zgodny ze stopniem agregacji przewidywanym w wynikach DLS, jednakże zaobserwowano pewne interesujące tendencje.Wbrew intuicji okazuje się, że najbardziej wrażliwa na zmiany SPR jest średniej wielkości AgNP-II, natomiast dwie pozostałe próbki są mniej wrażliwe.W badaniach SPR 50 nm jest teoretyczną granicą wielkości cząstek, która służy do rozróżniania cząstek na podstawie ich właściwości dielektrycznych.Cząstki mniejsze niż 50 nm (AgNP-I i AgNP-II) można opisać jako proste dipole dielektryczne, natomiast cząstki osiągające lub przekraczające tę granicę (AgNP-III) mają bardziej złożone właściwości dielektryczne i ich rezonans. Pasmo rozpada się na zmiany multimodalne .W przypadku dwóch mniejszych próbek cząstek AgNP można uznać za proste dipole, a plazma może z łatwością nakładać się na siebie.Wraz ze wzrostem wielkości cząstek, to sprzęganie zasadniczo wytwarza większą plazmę, co może wyjaśniać zaobserwowaną wyższą czułość.29 Jednak w przypadku największych cząstek proste oszacowanie dipolowe nie jest ważne, gdy mogą wystąpić również inne stany sprzężenia, co może wyjaśniać zmniejszoną tendencję AgNP-III do wskazywania zmian widmowych.29
W naszych warunkach eksperymentalnych udowodniono, że wartość pH ma głęboki wpływ na stabilność koloidalną nanocząstek srebra pokrytych cytrynianem o różnych rozmiarach.W tych układach stabilność zapewniają ujemnie naładowane grupy -COO- na powierzchni AgNP.Karboksylanowa grupa funkcyjna jonu cytrynianowego jest protonowana w dużej liczbie jonów H+, więc wytworzona grupa karboksylowa nie może już zapewniać odpychania elektrostatycznego między cząsteczkami, jak pokazano w górnym rzędzie na rysunku 4. Zgodnie z zasadą Le Chateliera AgNP próbki szybko agregują przy pH 3, ale stopniowo stają się coraz bardziej stabilne wraz ze wzrostem pH.
Rysunek 4 Schematyczny mechanizm oddziaływania powierzchniowego zdefiniowany przez agregację przy różnym pH (górny rząd), stężeniu NaCl (środkowy rząd) i biomolekułach (dolny rząd).
Zgodnie z rysunkiem 5, badano także stabilność koloidalną w zawiesinach AgNP o różnej wielkości przy rosnących stężeniach soli.Bazując na potencjale zeta, zwiększony rozmiar nanocząstek w tych układach AgNP zakończonych cytrynianem ponownie zapewnia zwiększoną odporność na wpływy zewnętrzne NaCl.W przypadku AgNP-I do wywołania łagodnej agregacji wystarczy 10 mM NaCl, a stężenie soli wynoszące 50 mM zapewnia bardzo podobne wyniki.W AgNP-II i AgNP-III 10 mM NaCl nie wpływa znacząco na potencjał zeta, ponieważ ich wartości utrzymują się na poziomie (AgNP-II) lub poniżej (AgNP-III) -30 mV.Zwiększenie stężenia NaCl do 50 mM i ostatecznie do 150 mM NaCl wystarczy, aby we wszystkich próbkach znacząco obniżyć wartość bezwzględną potencjału zeta, chociaż większe cząstki zachowują większy ładunek ujemny.Wyniki te są zgodne z oczekiwaną średnią średnicą hydrodynamiczną AgNP;średnie linie trendu Z zmierzone dla 10, 50 i 150 mM NaCl pokazują różne, stopniowo rosnące wartości.Na koniec we wszystkich trzech eksperymentach 150 mM wykryto agregaty wielkości mikronów.
Rysunek 5 Wyniki dynamicznego rozpraszania światła próbki nanocząstek srebra zakończonych cytrynianem o wzrastającym rozmiarze (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II i 50 nm: AgNP-III) wyrażono jako średnią średnicę hydrodynamiczną (średnia Z ) (po prawej) i potencjał zeta (po lewej) zmieniają się w ciągu 24 godzin przy różnych stężeniach NaCl.
Wyniki UV-Vis na rysunku uzupełniającym S2 pokazują, że SPR 50 i 150 mM NaCl we wszystkich trzech próbkach ma natychmiastowy i znaczący spadek.Można to wyjaśnić metodą DLS, ponieważ agregacja oparta na NaCl zachodzi szybciej niż eksperymenty zależne od pH, co można wytłumaczyć dużą różnicą między wczesnymi pomiarami (0, 1,5 i 3 godziny).Ponadto zwiększenie stężenia soli zwiększy również przenikalność względną ośrodka doświadczalnego, co będzie miało głęboki wpływ na powierzchniowy rezonans plazmonowy.29
Wpływ NaCl podsumowano w środkowym rzędzie rysunku 4. Ogólnie można stwierdzić, że zwiększenie stężenia chlorku sodu ma podobny efekt jak zwiększenie kwasowości, ponieważ jony Na+ mają tendencję do koordynowania się wokół grup karboksylanowych, tłumienie AgNP o ujemnym potencjale zeta.Ponadto 150 mM NaCl wytworzył we wszystkich trzech próbkach agregaty wielkości mikronów, co wskazuje, że fizjologiczne stężenie elektrolitu jest szkodliwe dla stabilności koloidalnej AgNP zakończonych cytrynianem.Uwzględniając krytyczne stężenie kondensacyjne (CCC) NaCl w podobnych układach AgNP, wyniki te można sprytnie umieścić w odpowiedniej literaturze.Huynh i in.obliczyli, że CCC NaCl dla nanocząstek srebra zakończonych cytrynianem o średniej średnicy 71 nm wyniosło 47,6 mM, natomiast El Badawy i in.zaobserwowali, że CCC 10 nm AgNP z powłoką cytrynianową wynosiło 70 mM.10,16 Ponadto He i wsp. zmierzyli znacząco wysokie CCC wynoszące około 300 mM, co spowodowało, że ich metoda syntezy różniła się od wspomnianej wcześniej publikacji.48 Chociaż obecny wkład nie ma na celu kompleksowej analizy tych wartości, ponieważ nasze warunki eksperymentalne zwiększają złożoność całego badania, biologicznie istotne stężenie NaCl wynoszące 50 mM, zwłaszcza 150 mM NaCl, wydaje się dość wysokie.Indukowana koagulacja, co wyjaśnia wykryte silne zmiany.
Następnym krokiem w eksperymencie polimeryzacji jest użycie prostych, ale biologicznie istotnych cząsteczek do symulacji interakcji nanocząstki-biocząsteczki.Na podstawie wyników DLS (rysunki 6 i 7) i UV-Vis (rysunki uzupełniające S3 i S4) można wyciągnąć pewne ogólne wnioski.W naszych warunkach eksperymentalnych badane cząsteczki glukozy i glutaminy nie będą indukować agregacji w żadnym układzie AgNP, ponieważ trend średniej Z jest ściśle powiązany z odpowiednią wartością pomiaru referencyjnego.Chociaż ich obecność nie wpływa na agregację, wyniki eksperymentów pokazują, że cząsteczki te są częściowo zaadsorbowane na powierzchni AgNP.Najważniejszym wynikiem potwierdzającym ten pogląd jest zaobserwowana zmiana absorpcji światła.Chociaż AgNP-I nie wykazuje znaczących zmian długości fali ani intensywności, można to zaobserwować wyraźniej mierząc większe cząstki, co najprawdopodobniej wynika z wspomnianej wcześniej większej czułości optycznej.Niezależnie od stężenia glukoza może powodować większe przesunięcie ku czerwieni po 1,5 godz. w porównaniu z pomiarem kontrolnym, które wynosi około 40 nm w AgNP-II i około 10 nm w AgNP-III, co świadczy o występowaniu oddziaływań powierzchniowych.Podobny trend wykazywała glutamina, aczkolwiek zmiana nie była aż tak oczywista.Dodatkowo warto również wspomnieć, że glutamina może zmniejszać bezwzględny potencjał zeta średnich i dużych cząstek.Jednakże, ponieważ wydaje się, że te zmiany zeta nie wpływają na poziom agregacji, można spekulować, że nawet małe biocząsteczki, takie jak glutamina, mogą zapewnić pewien stopień odpychania przestrzennego między cząsteczkami.
Rysunek 6 Wyniki dynamicznego rozpraszania światła próbek nanocząstek srebra zakończonych cytrynianem o wzrastającym rozmiarze (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II i 50 nm: AgNP-III) wyrażono jako średnią średnicę hydrodynamiczną (średnia Z) (po prawej) W warunkach zewnętrznych o różnym stężeniu glukozy potencjał zeta (po lewej) zmienia się w ciągu 24 godzin.
Rysunek 7 Wyniki dynamicznego rozpraszania światła próbki nanocząstek srebra zakończonych cytrynianem o wzrastającym rozmiarze (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II i 50 nm: AgNP-III) wyrażono jako średnią średnicę hydrodynamiczną (średnia Z ) (po prawej) W obecności glutaminy potencjał zeta (po lewej) zmienia się w ciągu 24 godzin.
Krótko mówiąc, małe biocząsteczki, takie jak glukoza i glutamina, nie wpływają na stabilność koloidalną w zmierzonym stężeniu: chociaż w różnym stopniu wpływają na potencjał zeta i wyniki UV-Vis, średnie wyniki Z nie są spójne.Wskazuje to, że powierzchniowa adsorpcja cząsteczek hamuje odpychanie elektrostatyczne, ale jednocześnie zapewnia stabilność wymiarową.
Aby powiązać poprzednie wyniki z poprzednimi wynikami i sprawniej symulować warunki biologiczne, wybraliśmy niektóre z najczęściej stosowanych składników hodowli komórkowych i wykorzystaliśmy je jako warunki eksperymentalne do badania stabilności koloidów AgNP.W całym eksperymencie in vitro jedną z najważniejszych funkcji DMEM jako podłoża jest ustalenie niezbędnych warunków osmotycznych, jednak z chemicznego punktu widzenia jest to złożony roztwór soli o całkowitej sile jonowej zbliżonej do 150 mM NaCl .40 Jeśli chodzi o FBS, jest to złożona mieszanina biomolekuł – głównie białek – z punktu widzenia adsorpcji powierzchniowej wykazuje pewne podobieństwa z wynikami eksperymentalnymi glukozy i glutaminy, pomimo składu chemicznego i różnorodności Płeć jest znacznie bardziej skomplikowana.19 DLS i UV — Widoczne wyniki pokazane odpowiednio na rysunku 8 i rysunku dodatkowym S5 można wyjaśnić poprzez zbadanie składu chemicznego tych materiałów i skorelowanie ich z pomiarami z poprzedniej sekcji.
Rysunek 8 Wyniki dynamicznego rozpraszania światła próbki nanocząstek srebra zakończonych cytrynianem o wzrastającym rozmiarze (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II i 50 nm: AgNP-III) wyrażono jako średnią średnicę hydrodynamiczną (średnia Z ) (po prawej) W obecności składników hodowli komórkowej DMEM i FBS potencjał zeta (po lewej) zmienia się w ciągu 24 godzin.
Rozcieńczanie AgNP o różnej wielkości w DMEM ma podobny wpływ na stabilność koloidalną, jak obserwowany w obecności wysokich stężeń NaCl.Dyspersja AgNP w 50 v/v% DMEM pokazała, że ​​agregację na dużą skalę wykryto wraz ze wzrostem potencjału zeta i wartością średnią Z oraz ostrym spadkiem intensywności SPR.Warto zauważyć, że maksymalna wielkość agregatu indukowana przez DMEM po 24 godzinach jest odwrotnie proporcjonalna do wielkości nanocząstek startera.
Oddziaływanie pomiędzy FBS i AgNP jest podobne do obserwowanego w obecności mniejszych cząsteczek, takich jak glukoza i glutamina, ale efekt jest silniejszy.Średnia Z cząstek pozostaje niezmieniona, podczas gdy wykrywany jest wzrost potencjału zeta.Pik SPR wykazywał lekkie przesunięcie w stronę czerwieni, ale co być może bardziej interesujące, intensywność SPR nie spadła tak znacząco jak w pomiarze kontrolnym.Wyniki te można wytłumaczyć wrodzoną adsorpcją makrocząsteczek na powierzchni nanocząstek (dolny rząd na rys. 4), co obecnie jest rozumiane jako tworzenie się korony biomolekularnej w organizmie.49