Uważa się, że nanocząsteczki srebra (AgNP) są potencjalnie użytecznym narzędziem do zwalczania różnych patogenów.Istnieją jednak obawy dotyczące uwalniania AgNP do mediów środowiskowych, ponieważ mogą one powodować niekorzystne skutki dla zdrowia ludzkiego i środowiska.W tym badaniu opracowaliśmy i oceniliśmy nowatorski magnetyczny koloid hybrydowy (MHC) o wielkości mikrometra ozdobiony AgNPs (AgNP-MHC) o różnej wielkości.Po zastosowaniu do dezynfekcji cząsteczki te można łatwo odzyskać z mediów środowiskowych dzięki ich właściwościom magnetycznym i pozostają skuteczne w inaktywacji patogenów wirusowych.Oceniliśmy skuteczność AgNP-MHC w inaktywacji bakteriofaga ϕX174, mysiego norowirusa (MNV) i adenowirusa serotypu 2 (AdV2).Te docelowe wirusy eksponowano na AgNP-MHC przez 1, 3 i 6 godzin w temperaturze 25°C, a następnie analizowano za pomocą testu łysinkowego i reakcji PCR TaqMan w czasie rzeczywistym.AgNP-MHC poddano działaniu szerokiego zakresu poziomów pH oraz wody wodociągowej i powierzchniowej, aby ocenić ich działanie przeciwwirusowe w różnych warunkach środowiskowych.Spośród trzech testowanych typów AgNP-MHC, Ag30-MHC wykazywały najwyższą skuteczność w inaktywacji wirusów.ϕX174 i MNV zmniejszyły się o ponad 2 log10 po ekspozycji na 4,6 × 109 Ag30-MHCs/ml przez 1 godzinę.Wyniki te wskazują, że AgNP-MHC można wykorzystać do inaktywacji patogenów wirusowych przy minimalnym ryzyku potencjalnego uwolnienia do środowiska.

Wraz z ostatnim postępem w nanotechnologii, nanocząsteczki cieszą się coraz większym zainteresowaniem na całym świecie w dziedzinach biotechnologii, medycyny i zdrowia publicznego (1,2).Ze względu na wysoki stosunek powierzchni do objętości, materiały nano, zwykle w zakresie od 10 do 500 nm, mają unikalne właściwości fizykochemiczne w porównaniu z większymi materiałami (1).Można kontrolować kształt i rozmiar nanomateriałów, a na ich powierzchni można koniugować określone grupy funkcyjne, aby umożliwić interakcje z określonymi białkami lub wychwyt wewnątrzkomórkowy (3,–5).

Nanocząsteczki srebra (AgNP) były szeroko badane jako środki przeciwdrobnoustrojowe (6).Srebro wykorzystywane jest do produkcji szlachetnych sztućców, do dekoracji i środków leczniczych.Związki srebra, takie jak sulfadiazyna srebra i niektóre sole, są stosowane jako produkty do opatrywania ran i leczenia chorób zakaźnych ze względu na ich właściwości przeciwdrobnoustrojowe (6,7).Ostatnie badania wykazały, że AgNP są bardzo skuteczne w inaktywacji różnych typów bakterii i wirusów (8,–11).Jony AgNP i Ag+ uwalniane z AgNP oddziałują bezpośrednio z biomolekułami zawierającymi fosfor lub siarkę, w tym DNA, RNA i białkami (12,–14).Wykazano również, że wytwarzają reaktywne formy tlenu (ROS), powodując uszkodzenie błon u mikroorganizmów (15).Rozmiar, kształt i stężenie AgNP są również ważnymi czynnikami wpływającymi na ich właściwości przeciwdrobnoustrojowe (8,10,13,16,17).

Poprzednie badania również uwydatniły kilka problemów związanych ze stosowaniem AgNP do zwalczania patogenów w środowisku wodnym.Po pierwsze, istniejące badania dotyczące skuteczności AgNP w inaktywacji patogenów wirusowych w wodzie są ograniczone.Ponadto monodyspersyjne AgNP są zazwyczaj podatne na agregację cząstek ze względu na ich mały rozmiar i dużą powierzchnię, a agregaty te zmniejszają skuteczność AgNP przeciwko patogenom drobnoustrojowym (7).Wreszcie wykazano, że AgNP mają różne działanie cytotoksyczne (5,18,–20), a uwolnienie AgNP do środowiska wodnego może skutkować problemami zdrowotnymi i ekologicznymi.

Niedawno opracowaliśmy nowatorski magnetyczny koloid hybrydowy (MHC) wielkości mikrometra ozdobiony AgNP o różnych rozmiarach (21,22).Rdzeń MHC można wykorzystać do odzyskiwania kompozytów AgNP ze środowiska.Oceniliśmy skuteczność przeciwwirusową tych nanocząstek srebra na MHC (AgNP-MHC) przy użyciu bakteriofaga ϕX174, mysiego norowirusa (MNV) i adenowirusa w różnych warunkach środowiskowych.

Działanie przeciwwirusowe AgNP-MHC w różnych stężeniach przeciwko bakteriofagowi ϕX174 ( a ), MNV ( b ) i AdV2 ( c ).Docelowe wirusy traktowano AgNP-MHC o różnych stężeniach i OH-MHC (4,6 x 109 cząstek/ml) jako kontrolę w inkubatorze z wytrząsaniem (150 obr./min, 1 godz., 25°C).Do pomiaru przeżywalności wirusów zastosowano metodę łysinkową.Wartości są średnimi ± odchyleniami standardowymi (SD) z trzech niezależnych eksperymentów.Gwiazdki wskazują znacząco różne wartości (P< 0,05 w jednoczynnikowej ANOVA z testem Dunnetta).

Badanie to wykazało, że AgNP-MHC są skuteczne w inaktywacji bakteriofagów i MNV, substytutu ludzkiego norowirusa, w wodzie.Ponadto AgNP-MHC można łatwo odzyskać za pomocą magnesu, skutecznie zapobiegając uwalnianiu potencjalnie toksycznych AgNP do środowiska.Szereg wcześniejszych badań wykazało, że stężenie i wielkość cząstek AgNP są czynnikami krytycznymi dla inaktywacji docelowych mikroorganizmów (8,16,17).Działanie przeciwdrobnoustrojowe AgNP zależy również od rodzaju mikroorganizmu.Skuteczność AgNP-MHC w inaktywacji ϕX174 wynikała z zależności dawka-odpowiedź.Wśród testowanych AgNP-MHC, Ag30-MHC wykazywały wyższą skuteczność w inaktywacji ϕX174 i MNV.W przypadku MNV tylko Ag30-MHC wykazywały aktywność przeciwwirusową, podczas gdy inne AgNP-MHC nie powodowały żadnej znaczącej inaktywacji MNV.Żaden z AgNP-MHC nie wykazywał znaczącej aktywności przeciwwirusowej przeciwko AdV2.

Oprócz wielkości cząstek ważne było również stężenie srebra w AgNP-MHC.Stężenie srebra wydawało się determinować skuteczność przeciwwirusowego działania AgNP-MHC.Stężenia srebra w roztworach Ag07-MHC i Ag30-MHC przy 4,6 × 109 cząstek/ml wynosiły odpowiednio 28,75 ppm i 200 ppm i korelowały z poziomem aktywności przeciwwirusowej.Tabela 2podsumowuje stężenia srebra i pola powierzchni badanych AgNP-MHC.Ag07-MHC wykazywały najniższą aktywność przeciwwirusową i miały najniższe stężenie srebra i najmniejsze pole powierzchni, co sugeruje, że te właściwości są związane z przeciwwirusową aktywnością AgNP-MHC.

Nasze poprzednie badanie wykazało, że główne mechanizmy przeciwdrobnoustrojowe AgNP-MHC to chemiczna abstrakcja jonów Mg2+ lub Ca2+ z błon drobnoustrojów, tworzenie kompleksów z grupami tiolowymi zlokalizowanymi na błonach oraz wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS) (21).Ponieważ AgNP-MHC mają stosunkowo duży rozmiar cząstek (około 500 nm), jest mało prawdopodobne, aby mogły one przeniknąć przez kapsyd wirusa.Zamiast tego wydaje się, że AgNP-MHC oddziałują z białkami powierzchniowymi wirusa.AgNP na kompozytach mają tendencję do wiązania biomolekuł zawierających grupy tiolowe osadzonych w białkach otoczki wirusów.Dlatego właściwości biochemiczne wirusowych białek kapsydu są ważne dla określenia ich podatności na AgNP-MHC.Rysunek 1pokazuje różną podatność wirusów na działanie AgNP-MHC.Bakteriofagi ϕX174 i MNV były wrażliwe na AgNP-MHC, ale AdV2 był oporny.Wysoki poziom oporności AdV2 jest prawdopodobnie związany z jego rozmiarem i strukturą.Adenowirusy mają wielkość od 70 do 100 nm (30), co czyni je znacznie większymi niż ϕX174 (27 do 33 nm) i MNV (28 do 35 nm) (31,32).Oprócz dużych rozmiarów, adenowirusy, w przeciwieństwie do innych wirusów, mają dwuniciowy DNA i są odporne na różne stresy środowiskowe, takie jak ciepło i promieniowanie UV (33,34).Nasze poprzednie badanie wykazało, że w przypadku Ag30-MHC w ciągu 6 godzin wystąpiła redukcja MS2 o prawie 3 log10 (21).MS2 i ϕX174 mają podobne rozmiary z różnymi typami kwasów nukleinowych (RNA lub DNA), ale mają podobny współczynnik inaktywacji przez Ag30-MHC.Dlatego też charakter kwasu nukleinowego nie wydaje się być głównym czynnikiem oporności na AgNP-MHC.Zamiast tego, rozmiar i kształt cząstki wirusa okazały się ważniejsze, ponieważ adenowirus jest wirusem znacznie większym.Ag30-MHC osiągnęły prawie 2-log10 redukcję M13 w ciągu 6 godzin (nasze niepublikowane dane).M13 to wirus jednoniciowego DNA (35) i ma długość ~880 nm i średnicę 6,6 nm (36).Szybkość inaktywacji nitkowatego bakteriofaga M13 była pośrednia pomiędzy szybkością małych wirusów o okrągłej strukturze (MNV, ϕX174 i MS2) a dużym wirusem (AdV2).

W niniejszym badaniu kinetyka inaktywacji MNV różniła się znacząco w teście łysinkowym i teście RT-PCR (Ryc. 2bI​andc).c).Wiadomo, że testy molekularne, takie jak RT-PCR, znacznie zaniżają współczynnik inaktywacji wirusów (25,28), jak stwierdzono w naszym badaniu.Ponieważ AgNP-MHC oddziałują głównie z powierzchnią wirusa, jest bardziej prawdopodobne, że uszkodzą białka płaszcza wirusa niż wirusowe kwasy nukleinowe.Dlatego też test RT-PCR służący do pomiaru wirusowego kwasu nukleinowego może znacząco niedoszacować inaktywację wirusów.Za inaktywację badanych wirusów powinno odpowiadać działanie jonów Ag+ i wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS).Jednakże wiele aspektów mechanizmów przeciwwirusowych AgNP-MHC jest nadal niejasnych i konieczne są dalsze badania z wykorzystaniem podejść biotechnologicznych w celu wyjaśnienia mechanizmu wysokiej oporności AdV2.

Na koniec oceniliśmy skuteczność działania przeciwwirusowego Ag30-MHC, wystawiając je na działanie szerokiego zakresu wartości pH oraz próbki wody wodociągowej i powierzchniowej przed pomiarem ich aktywności przeciwwirusowej (Ryc. 3I​i4).4).Ekspozycja na warunki skrajnie niskiego pH spowodowała fizyczną i/lub funkcjonalną utratę AgNP z MHC (dane niepublikowane).W obecności niespecyficznych cząstek Ag30-MHC konsekwentnie wykazywały aktywność przeciwwirusową, pomimo spadku aktywności przeciwwirusowej wobec MS2.Aktywność przeciwwirusowa była najniższa w niefiltrowanej wodzie powierzchniowej, ponieważ interakcja pomiędzy Ag30-MHC i niespecyficznymi cząsteczkami w bardzo mętnej wodzie powierzchniowej prawdopodobnie spowodowała zmniejszenie aktywności przeciwwirusowej (Tabela 3).Dlatego w przyszłości powinny zostać przeprowadzone badania terenowe AgNP-MHC w różnych rodzajach wody (np. o różnym stężeniu soli lub kwasu humusowego).

Podsumowując, nowe kompozyty Ag, AgNP-MHC, mają doskonałe właściwości przeciwwirusowe przeciwko kilku wirusom, w tym ϕX174 i MNV.AgNP-MHC zachowują wysoką skuteczność w różnych warunkach środowiskowych, a cząstki te można łatwo odzyskać za pomocą magnesu, zmniejszając w ten sposób ich potencjalny szkodliwy wpływ na zdrowie ludzkie i środowisko.Badanie to wykazało, że kompozyt AgNP może być skutecznym środkiem przeciwwirusowym w różnych warunkach środowiskowych, bez znaczącego ryzyka ekologicznego.