Nanopartículas de prata (AgNPs) são consideradas uma ferramenta potencialmente útil para controlar vários patógenos.No entanto, existem preocupações sobre a liberação de AgNPs em meios ambientais, pois podem gerar efeitos adversos à saúde humana e ecológicos.Neste estudo, desenvolvemos e avaliamos um novo colóide híbrido magnético (MHC) de tamanho micrométrico decorado com AgNPs de tamanhos variados (AgNP-MHCs).Após serem aplicadas para desinfecção, essas partículas podem ser facilmente recuperadas do meio ambiental usando suas propriedades magnéticas e permanecem eficazes na inativação de patógenos virais.Avaliamos a eficácia dos AgNP-MHCs na inativação do bacteriófago ϕX174, norovírus murino (MNV) e adenovírus sorotipo 2 (AdV2).Estes vírus alvo foram expostos a AgNP-MHCs durante 1, 3 e 6 horas a 25°C e depois analisados ​​por ensaio de placa e PCR TaqMan em tempo real.Os AgNP-MHCs foram expostos a uma ampla gama de níveis de pH e à água da torneira e de superfície para avaliar seus efeitos antivirais sob diferentes condições ambientais.Entre os três tipos de AgNP-MHCs testados, os Ag30-MHCs apresentaram a maior eficácia na inativação dos vírus.O ϕX174 e o MNV foram reduzidos em mais de 2 log10 após exposição a 4,6 × 109 Ag30-MHCs/ml por 1 h.Estes resultados indicaram que os AgNP-MHCs poderiam ser usados ​​para inativar patógenos virais com chance mínima de liberação potencial no ambiente.

Com os recentes avanços na nanotecnologia, as nanopartículas têm recebido cada vez mais atenção em todo o mundo nas áreas de biotecnologia, medicina e saúde pública.1,2).Devido à sua alta relação superfície-volume, os materiais nanométricos, normalmente variando de 10 a 500 nm, têm propriedades físico-químicas únicas em comparação com materiais maiores.1).A forma e o tamanho dos nanomateriais podem ser controlados, e grupos funcionais específicos podem ser conjugados nas suas superfícies para permitir interações com certas proteínas ou captação intracelular.3,–5).

Nanopartículas de prata (AgNPs) têm sido amplamente estudadas como agente antimicrobiano (6).A prata é utilizada na confecção de talheres finos, na ornamentação e em agentes terapêuticos.Compostos de prata, como a sulfadiazina de prata e certos sais, têm sido utilizados como produtos para tratamento de feridas e como tratamentos para doenças infecciosas devido às suas propriedades antimicrobianas.6,7).Estudos recentes revelaram que as AgNPs são muito eficazes na inativação de vários tipos de bactérias e vírus.8,–11).AgNPs e íons Ag+ liberados de AgNPs interagem diretamente com biomoléculas contendo fósforo ou enxofre, incluindo DNA, RNA e proteínas.12,–14).Também foi demonstrado que eles geram espécies reativas de oxigênio (ROS), causando danos à membrana em microrganismos.15).O tamanho, forma e concentração das AgNPs também são fatores importantes que afetam suas capacidades antimicrobianas.8,10,13,16,17).

Estudos anteriores também destacaram vários problemas quando AgNPs são usados ​​para controlar patógenos em ambiente aquático.Primeiro, os estudos existentes sobre a eficácia das AgNPs na inativação de patógenos virais na água são limitados.Além disso, as AgNPs monodispersas estão normalmente sujeitas à agregação partícula-partícula devido ao seu pequeno tamanho e grande área superficial, e esses agregados reduzem a eficácia das AgNPs contra patógenos microbianos.7).Finalmente, foi demonstrado que os AgNPs têm vários efeitos citotóxicos (5,18,–20), e a liberação de AgNPs em um ambiente aquático pode resultar em problemas ecológicos e de saúde humana.

Recentemente, desenvolvemos um novo colóide híbrido magnético (MHC) de tamanho micrométrico decorado com AgNPs de vários tamanhos (21,22).O núcleo MHC pode ser usado para recuperar os compósitos AgNP do meio ambiente.Avaliamos a eficácia antiviral dessas nanopartículas de prata em MHCs (AgNP-MHCs) usando bacteriófago ϕX174, norovírus murino (MNV) e adenovírus sob diferentes condições ambientais.

Efeitos antivirais de AgNP-MHCs em várias concentrações contra o bacteriófago ϕX174 (a), MNV (b) e AdV2 (c).Os vírus alvo foram tratados com diferentes concentrações de AgNP-MHCs e com OH-MHCs (4,6 x 109 partículas/ml) como controle, em uma incubadora com agitação (150 rpm, 1 h, 25°C).O método de ensaio de placa foi usado para medir vírus sobreviventes.Os valores são médias ± desvios padrão (DP) de três experimentos independentes.Os asteriscos indicam valores significativamente diferentes (P<0,05 por ANOVA unidirecional com teste de Dunnett).

Este estudo demonstrou que os AgNP-MHCs são eficazes para inativar bacteriófagos e MNV, um substituto do norovírus humano, na água.Além disso, os AgNP-MHCs podem ser facilmente recuperados com um ímã, evitando efetivamente a liberação de AgNPs potencialmente tóxicos no meio ambiente.Vários estudos anteriores mostraram que a concentração e o tamanho das partículas de AgNPs são fatores críticos para a inativação de microrganismos alvo.8,16,17).Os efeitos antimicrobianos das AgNPs também dependem do tipo de microrganismo.A eficácia dos AgNP-MHCs para inativar ϕX174 seguiu uma relação dose-resposta.Entre os AgNP-MHCs testados, os Ag30-MHCs tiveram maior eficácia na inativação de ϕX174 e MNV.Para MNV, apenas Ag30-MHCs apresentaram atividade antiviral, com os demais AgNP-MHCs não gerando qualquer inativação significativa de MNV.Nenhum dos AgNP-MHCs apresentou atividade antiviral significativa contra AdV2.

Além do tamanho das partículas, a concentração de prata nos AgNP-MHCs também foi importante.A concentração de prata pareceu determinar a eficácia dos efeitos antivirais dos AgNP-MHCs.As concentrações de prata em soluções de Ag07-MHCs e Ag30-MHCs a 4,6 × 109 partículas/ml foram 28,75 ppm e 200 ppm, respectivamente, e correlacionadas com o nível de atividade antiviral.mesa 2resume as concentrações de prata e áreas superficiais dos AgNP-MHCs testados.Os Ag07-MHCs apresentaram a menor atividade antiviral e tiveram a menor concentração de prata e área superficial, sugerindo que essas propriedades estão relacionadas à atividade antiviral dos AgNP-MHCs.

Nosso estudo anterior indicou que os principais mecanismos antimicrobianos dos AgNP-MHCs são a abstração química de íons Mg2+ ou Ca2+ das membranas microbianas, a criação de complexos com grupos tiol localizados nas membranas e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) (21).Como os AgNP-MHCs têm um tamanho de partícula relativamente grande (~500 nm), é improvável que possam penetrar no capsídeo viral.Em vez disso, os AgNP-MHCs parecem interagir com proteínas de superfície viral.AgNPs nos compósitos tendem a se ligar a biomoléculas contendo grupos tiol incorporadas nas proteínas do revestimento dos vírus.Portanto, as propriedades bioquímicas das proteínas do capsídeo viral são importantes para determinar sua suscetibilidade aos AgNP-MHCs.figura 1mostra as diferentes suscetibilidades dos vírus aos efeitos dos AgNP-MHCs.Os bacteriófagos ϕX174 e MNV foram suscetíveis aos AgNP-MHCs, mas o AdV2 foi resistente.O alto nível de resistência do AdV2 provavelmente está associado ao seu tamanho e estrutura.Os adenovírus variam em tamanho de 70 a 100 nm (30), tornando-os muito maiores que ϕX174 (27 a 33 nm) e MNV (28 a 35 nm) (31,32).Além de seu grande tamanho, os adenovírus possuem DNA de fita dupla, diferentemente de outros vírus, e são resistentes a diversos estresses ambientais, como calor e radiação UV.33,34).Nosso estudo anterior relatou que uma redução de quase 3 log10 de MS2 ocorreu com Ag30-MHCs dentro de 6 horas (21).MS2 e ϕX174 têm tamanhos semelhantes com diferentes tipos de ácidos nucleicos (RNA ou DNA), mas têm taxas semelhantes de inativação por Ag30-MHCs.Portanto, a natureza do ácido nucleico não parece ser o principal fator de resistência aos AgNP-MHCs.Em vez disso, o tamanho e a forma da partícula viral pareciam ser mais importantes, porque o adenovírus é um vírus muito maior.Os Ag30-MHCs alcançaram uma redução de quase 2 log10 de M13 em 6 horas (nossos dados não publicados).M13 é um vírus de DNA de fita simples (35) e tem 880 nm de comprimento e 6,6 nm de diâmetro (36).A taxa de inativação do bacteriófago filamentoso M13 foi intermediária entre as de vírus pequenos e de estrutura redonda (MNV, ϕX174 e MS2) e de um vírus grande (AdV2).

No presente estudo, a cinética de inativação da MNV foi significativamente diferente no ensaio de placas e no ensaio de RT-PCR (Figura 2beec).c).Sabe-se que ensaios moleculares como RT-PCR subestimam significativamente as taxas de inativação de vírus (25,28), como foi encontrado em nosso estudo.Como os AgNP-MHCs interagem principalmente com a superfície viral, é mais provável que danifiquem as proteínas do revestimento viral do que os ácidos nucleicos virais.Portanto, um ensaio RT-PCR para medir o ácido nucleico viral pode subestimar significativamente a inativação dos vírus.O efeito dos íons Ag+ e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) devem ser responsáveis ​​pela inativação dos vírus testados.No entanto, muitos aspectos dos mecanismos antivirais dos AgNP-MHCs ainda não estão claros, e mais pesquisas utilizando abordagens biotecnológicas são necessárias para elucidar o mecanismo da alta resistência do AdV2.

Finalmente, avaliamos a robustez da atividade antiviral dos Ag30-MHCs, expondo-os a uma ampla faixa de valores de pH e a amostras de água de torneira e de superfície antes de medir sua atividade antiviral (Figura 3ee4).4).A exposição a condições de pH extremamente baixo resultou na perda física e/ou funcional de AgNPs do MHC (dados não publicados).Na presença de partículas inespecíficas, os Ag30-MHCs exibiram consistentemente atividade antiviral, apesar de um declínio na atividade antiviral contra MS2.A atividade antiviral foi mais baixa em águas superficiais não filtradas, já que uma interação entre Ag30-MHCs e partículas inespecíficas nas águas superficiais altamente turvas provavelmente causou uma redução da atividade antiviral.Tabela 3).Portanto, avaliações de campo de AgNP-MHCs em vários tipos de água (por exemplo, com diferentes concentrações de sal ou ácido húmico) deverão ser realizadas no futuro.

Concluindo, os novos compostos Ag, AgNP-MHCs, possuem excelentes capacidades antivirais contra vários vírus, incluindo ϕX174 e MNV.Os AgNP-MHCs mantêm forte eficácia sob diferentes condições ambientais, e essas partículas podem ser facilmente recuperadas usando um ímã, reduzindo assim seus potenciais efeitos nocivos à saúde humana e ao meio ambiente.Este estudo mostrou que o composto AgNP pode ser um antiviral eficaz em vários ambientes ambientais, sem riscos ecológicos significativos.