В настоящее время в вашем браузере отключен Javascript.Когда JavaScript отключен, некоторые функции этого сайта не будут работать.
Зарегистрируйте свои конкретные данные и конкретные интересующие вас лекарства, и мы сопоставим предоставленную вами информацию со статьями в нашей обширной базе данных и своевременно отправим вам копию в формате PDF по электронной почте.
Всегда ли меньшие наночастицы лучше?Понять биологические эффекты зависящей от размера агрегации наночастиц серебра в биологически значимых условиях.
Авторы: Белтеки П., Ронавари А., Закупски Д., Бока Е., Игаз Н., Серенчес Б., Пфайффер И., Вагвёлдьи С., Киричи М., Конья З.
Петер Белтеки,1,* Андреа Ронавари,1,* Далма Закупски,1 Эстер Бока,1 Нора Игаз,2 Беттина Серенчес,3 Илона Пфайффер,3 Чаба Вагвёлдьи,3 Моника Киричи, Химия окружающей среды, Венгрия, Венгрия Факультет естественных наук и информатики , Университет Сегеда;2 Кафедра биохимии и молекулярной биологии, факультет науки и информации, Сегедский университет, Венгрия;3 Кафедра микробиологии, факультет науки и информации, Сегедский университет, Венгрия;4MTA-SZTE Группа исследований кинетики реакций и химии поверхности, Сегед, Венгрия* Эти авторы внесли равный вклад в эту работу.Сообщение: Золтан Конья Кафедра прикладной химии и химии окружающей среды, факультет науки и информатики, Университет Сегеда, площадь Рериха 1, Сегед, H-6720, Венгрия Телефон +36 62 544620 Электронная почта [защита электронной почты] Цель: наночастицы серебра (AgNP) один из наиболее часто изучаемых наноматериалов, особенно из-за их биомедицинского применения.Однако из-за агрегации наночастиц их превосходная цитотоксичность и антибактериальная активность часто нарушаются в биологических средах.В этой работе были изучены агрегационное поведение и связанная с ним биологическая активность трех различных образцов наночастиц серебра с цитратными концевыми группами со средним диаметром 10, 20 и 50 нм.Метод: Используйте просвечивающий электронный микроскоп для синтеза и характеристики наночастиц, оценки их агрегационного поведения при различных значениях pH, концентрациях NaCl, глюкозы и глутамина методами динамического рассеяния света и ультрафиолето-видимой спектроскопии.Кроме того, компоненты среды для культивирования клеток, такие как Дульбекко, улучшают агрегационное поведение в среде Игла и фетальной телячьей сыворотке.Результаты: Результаты показывают, что кислый pH и физиологическое содержание электролитов обычно вызывают агрегацию микронного масштаба, которая может быть опосредована образованием биомолекулярной короны.Стоит отметить, что более крупные частицы проявляют более высокую устойчивость к внешним воздействиям, чем их более мелкие аналоги.Цитотоксичность и антибактериальные тесты in vitro проводили путем обработки клеток агрегатами наночастиц на разных стадиях агрегации.Заключение: Наши результаты показывают глубокую корреляцию между коллоидной стабильностью и токсичностью AgNP, поскольку чрезмерная агрегация приводит к полной потере биологической активности.Более высокая степень антиагрегации, наблюдаемая для более крупных частиц, оказывает существенное влияние на токсичность in vitro, поскольку такие образцы сохраняют большую антимикробную активность и активность клеток млекопитающих.Эти результаты приводят к выводу, что, несмотря на общее мнение в соответствующей литературе, нацеливание на наночастицы наименьшего размера может быть не лучшим способом действий.Ключевые слова: рост, опосредованный семенами, коллоидная стабильность, размерозависимое агрегационное поведение, токсичность агрегатного повреждения.
Поскольку спрос и объем производства наноматериалов продолжают расти, все больше внимания уделяется их биобезопасности или биологической активности.Наночастицы серебра (AgNP) являются одними из наиболее часто синтезируемых, исследуемых и используемых представителей этого класса материалов из-за их превосходных каталитических, оптических и биологических свойств.1 Принято считать, что уникальные характеристики наноматериалов (в том числе AgNP) обусловлены, главным образом, их большой удельной поверхностью.Таким образом, неизбежной проблемой является любой процесс, который влияет на эту ключевую характеристику, например, размер частиц, покрытие поверхности или агрегацию, независимо от того, приведет ли он к серьезному повреждению свойств наночастиц, которые имеют решающее значение для конкретных применений.
Влияние размера частиц и стабилизаторов относительно хорошо описано в литературе.Например, общепринятое мнение состоит в том, что наночастицы меньшего размера более токсичны, чем наночастицы большего размера.2 В соответствии с общей литературой, наши предыдущие исследования продемонстрировали зависящую от размера активность наносеребра на клетках млекопитающих и микроорганизмах.3–5 Покрытие поверхности – еще один атрибут, который оказывает широкое влияние на свойства наноматериалов.Просто добавив или модифицировав стабилизаторы на своей поверхности, один и тот же наноматериал может иметь совершенно разные физические, химические и биологические свойства.Нанесение покрывающих агентов чаще всего осуществляется в рамках синтеза наночастиц.Например, наночастицы серебра с цитратными концевыми группами являются одними из наиболее важных AgNP в исследованиях, которые синтезируются путем восстановления солей серебра в выбранном растворе стабилизатора в качестве реакционной среды.6 Цитрат может легко воспользоваться преимуществами своей низкой стоимости, доступности, биосовместимости и сильного сродства к серебру, что может быть отражено в различных предполагаемых взаимодействиях, от обратимой поверхностной адсорбции до ионных взаимодействий.Малые молекулы и многоатомные ионы около 7,8, такие как цитраты, полимеры, полиэлектролиты и биологические агенты, также обычно используются для стабилизации наносеребра и выполнения с ним уникальных функционализаций.9-12
Хотя возможность изменения активности наночастиц путем преднамеренного покрытия поверхности является очень интересной областью, основная роль этого поверхностного покрытия незначительна, обеспечивая коллоидную стабильность системы наночастиц.Большая удельная поверхность наноматериалов будет производить большую поверхностную энергию, что препятствует термодинамической способности системы достигать минимальной энергии.13 Без надлежащей стабилизации это может привести к агломерации наноматериалов.Агрегация – это образование агрегатов частиц различной формы и размера, происходящее при встрече дисперсных частиц и текущих термодинамических взаимодействиях, позволяющих частицам слипаться друг с другом.Поэтому стабилизаторы используются для предотвращения агрегации путем введения между частицами достаточно большой силы отталкивания, противодействующей их термодинамическому притяжению.14
Хотя вопрос размера частиц и покрытия поверхности был тщательно изучен в контексте регуляции биологической активности, вызываемой наночастицами, агрегация частиц остается в значительной степени игнорируемой областью.Тщательных исследований по определению коллоидной стабильности наночастиц в биологически значимых условиях почти не проводилось.10,15-17 Кроме того, этот вклад особенно редок, когда также изучалась токсичность, связанная с агрегацией, даже если она может вызывать побочные реакции, такие как тромбоз сосудов, или потерю желаемых характеристик, таких как токсичность, как показано на рисунке 1.18, показано 19.Фактически, один из немногих известных механизмов устойчивости к наночастицам серебра связан с агрегацией, поскольку, как сообщается, некоторые штаммы E. coli и Pseudomonas aeruginosa снижают свою чувствительность к наночастицам серебра за счет экспрессии белка флагеллина, флагеллина.Он имеет высокое сродство к серебру, тем самым вызывая агрегацию.20
Существует несколько различных механизмов, связанных с токсичностью наночастиц серебра, и агрегация влияет на все эти механизмы.Наиболее обсуждаемый метод биологической активности AgNP, иногда называемый механизмом «троянского коня», рассматривает AgNP как носители Ag+.1,21 Механизм «троянского коня» может обеспечить значительное увеличение локальной концентрации Ag+, что приводит к генерации АФК и деполяризации мембраны.22-24 Агрегация может влиять на высвобождение Ag+, тем самым влияя на токсичность, поскольку она уменьшает эффективную активную поверхность, на которой ионы серебра могут окисляться и растворяться.Однако AgNP проявляют токсичность не только за счет высвобождения ионов.Необходимо учитывать множество взаимодействий, связанных с размером и морфологией.Среди них определяющими характеристиками являются размер и форма поверхности наночастиц.4,25 Совокупность этих механизмов можно отнести к категории «механизмы индуцированной токсичности».Потенциально существует множество митохондриальных и поверхностных мембранных реакций, которые могут повредить органеллы и вызвать гибель клеток.25-27 Поскольку образование агрегатов естественным образом влияет на размер и форму серебросодержащих объектов, распознаваемых живыми системами, эти взаимодействия также могут влиять.
В нашей предыдущей статье об агрегации наночастиц серебра мы продемонстрировали эффективную процедуру скрининга, состоящую из химических и биологических экспериментов in vitro, для изучения этой проблемы.19 Динамическое рассеяние света (DLS) является предпочтительным методом для такого рода проверок, поскольку материал может рассеивать фотоны на длине волны, сравнимой с размером его частиц.Поскольку скорость броуновского движения частиц в жидкой среде связана с размером, изменение интенсивности рассеянного света можно использовать для определения среднего гидродинамического диаметра (Z-mean) жидкой пробы.28 Кроме того, приложив к образцу напряжение, можно измерить дзета-потенциал (ζ-потенциал) наночастицы аналогично среднему значению Z.13,28 Если абсолютное значение зета-потенциала достаточно велико (в соответствии с общими рекомендациями > ±30 мВ), оно будет генерировать сильное электростатическое отталкивание между частицами для противодействия агрегации.Характеристический поверхностный плазмонный резонанс (ППР) — уникальное оптическое явление, в основном приписываемое наночастицам драгоценных металлов (в основном Au и Ag).29​​ Основываясь на электронных колебаниях (поверхностных плазмонах) этих материалов на наноуровне, известно, что сферические AgNP имеют характерный пик поглощения в УФ-видимом диапазоне около 400 нм.30 Интенсивность и сдвиг длины волны частиц используются для дополнения результатов ДРС, поскольку этот метод можно использовать для обнаружения агрегации наночастиц и поверхностной адсорбции биомолекул.
На основе полученной информации проводятся анализы жизнеспособности клеток (МТТ) и антибактериальные свойства таким образом, чтобы токсичность AgNP описывалась как функция уровня агрегации, а не (наиболее часто используемый фактор) концентрации наночастиц.Этот уникальный метод позволяет нам продемонстрировать огромную важность уровня агрегации для биологической активности, поскольку, например, AgNP с цитратными концевыми группами полностью теряют свою биологическую активность в течение нескольких часов из-за агрегации.19
В текущей работе мы стремимся значительно расширить наш предыдущий вклад в стабильность биологических коллоидов и их влияние на биологическую активность путем изучения влияния размера наночастиц на агрегацию наночастиц.Это, несомненно, одно из исследований наночастиц.31 Для исследования этой проблемы был использован метод роста, опосредованный семенами, для получения AgNP с цитратными концевыми группами в трех различных диапазонах размеров (10, 20 и 50 нм).6,32 как один из наиболее распространенных методов.Для наноматериалов, которые широко и регулярно используются в медицинских целях, выбираются AgNP с цитратными концевыми группами разных размеров для изучения возможной размерной зависимости биологических свойств наносеребра, связанных с агрегацией.После синтеза AgNP разных размеров мы охарактеризовали полученные образцы с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), а затем исследовали частицы с помощью вышеупомянутой процедуры скрининга.Кроме того, в присутствии клеточных культур in vitro, модифицированной среды Игла Дульбекко (DMEM) и фетальной бычьей сыворотки (FBS), размерно-зависимое поведение агрегации и ее поведение оценивали при различных значениях pH, концентрациях NaCl, глюкозы и глутамина.Характеристики цитотоксичности определяются в комплексных условиях.Научный консенсус указывает на то, что в целом более мелкие частицы предпочтительнее;Наше исследование предоставляет химическую и биологическую платформу, позволяющую определить, так ли это.
Три наночастицы серебра с разным диапазоном размеров были получены методом выращивания с использованием затравки, предложенным Ваном и др., с небольшими корректировками.6 Этот метод основан на химическом восстановлении с использованием нитрата серебра (AgNO3) в качестве источника серебра, борогидрида натрия (NaBH4) в качестве восстановителя и цитрата натрия в качестве стабилизатора.Сначала приготовьте 75 мл 9 мМ водного раствора цитрата из дигидрата цитрата натрия (Na3C6H5O7 x 2H2O) и нагрейте до 70°C.Затем к реакционной среде добавляли 2 мл 1%-ного раствора AgNO3, а затем к смеси по каплям приливали свежеприготовленный раствор боргидрида натрия (2 мл 0,1%-ного мас./об.).Полученную желто-коричневую суспензию выдерживали при температуре 70°С при интенсивном перемешивании в течение 1 часа, а затем охлаждали до комнатной температуры.Полученный образец (далее именуемый AgNP-I) используется в качестве основы для роста, опосредованного семенами, на следующем этапе синтеза.
Чтобы синтезировать суспензию частиц среднего размера (обозначенную как AgNP-II), нагрейте 90 мл 7,6 мМ раствора цитрата до 80°C, смешайте его с 10 мл AgNP-I, а затем смешайте 2 мл 1% раствора AgNO3. выдерживали при интенсивном механическом перемешивании в течение 1 часа, а затем образец охлаждали до комнатной температуры.
Для самой большой частицы (AgNP-III) повторите тот же процесс роста, но в этом случае используйте 10 мл AgNP-II в качестве суспензии семян.После того, как образцы достигают комнатной температуры, их номинальную концентрацию Ag, исходя из общего содержания AgNO3, устанавливают на уровне 150 частей на миллион путем добавления или выпаривания дополнительного растворителя при 40°C, и, наконец, хранят их при 4°C до дальнейшего использования.
Используйте трансмиссионный электронный микроскоп FEI Tecnai G2 20 X-Twin (ТЕМ) (штаб-квартира FEI, Хиллсборо, Орегон, США) с ускоряющим напряжением 200 кВ для изучения морфологических характеристик наночастиц и регистрации их картины дифракции электронов (ED).По крайней мере, 15 репрезентативных изображений (~750 частиц) были оценены с использованием программного пакета ImageJ, а полученные гистограммы (и все графики во всем исследовании) были созданы в OriginPro 2018 (OriginLab, Нортгемптон, Массачусетс, США) 33, 34.
Средний гидродинамический диаметр (Z-среднее), дзета-потенциал (ζ-потенциал) и характерный поверхностный плазмонный резонанс (SPR) образцов были измерены для иллюстрации их исходных коллоидных свойств.Средний гидродинамический диаметр и зета-потенциал образца измеряли с помощью прибора Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Малверн, Великобритания) с использованием одноразовых сложенных капиллярных ячеек при температуре 37±0,1°C.Спектрофотометр Ocean Optics 355 DH-2000-BAL UV-Vis (Halma PLC, Ларго, Флорида, США) использовался для получения характерных характеристик SPR из спектров поглощения UV-Vis образцов в диапазоне 250-800 нм.
В течение всего эксперимента одновременно проводились три различных типа измерений, связанных с коллоидной стабильностью.Используйте DLS для измерения среднего гидродинамического диаметра (среднее Z) и дзета-потенциала (ζ-потенциал) частиц, поскольку среднее значение Z связано со средним размером агрегатов наночастиц, а дзета-потенциал указывает на наличие электростатического отталкивания в системе. достаточно силен, чтобы компенсировать притяжение Ван-дер-Ваальса между наночастицами.Измерения проводятся в трех экземплярах, а стандартное отклонение Z-среднего и дзета-потенциала рассчитывается с помощью программного обеспечения Zetasizer.Характеристические спектры ППР частиц оцениваются с помощью УФ-ВИД-спектроскопии, поскольку изменения пиковой интенсивности и длины волны могут указывать на агрегацию и поверхностные взаимодействия.29,35 Фактически, поверхностный плазмонный резонанс в драгоценных металлах настолько важен, что привел к появлению новых методов анализа биомолекул.29,36,37 Концентрация AgNP в экспериментальной смеси составляет около 10 ppm, и цель состоит в том, чтобы установить интенсивность максимального начального поглощения ППР равной 1. Эксперимент проводился в зависимости от времени при 0;1,5;3;6;12 и 24 часа в различных биологически значимых условиях.Более подробное описание эксперимента можно увидеть в нашей предыдущей работе.19 Короче говоря, разные значения pH (3; 5; 7,2 и 9), разные концентрации хлорида натрия (10 мМ; 50 мМ; 150 мМ), глюкозы (3,9 мМ; 6,7 мМ) и глутамина (4 мМ) и также подготовили модифицированную среду Игла Дульбекко (DMEM) и фетальную бычью сыворотку (FBS) (в воде и DMEM) в качестве модельных систем и изучили их влияние на агрегационное поведение синтезированных наночастиц серебра.pH. Значения NaCl, глюкозы и глутамина оцениваются на основе физиологических концентраций, тогда как количества DMEM и FBS такие же, как уровни, использованные во всем эксперименте in vitro.38-42 Все измерения проводились при pH 7,2 и 37°C с постоянной фоновой концентрацией соли 10 мМ NaCl, чтобы исключить любые взаимодействия частиц на больших расстояниях (за исключением некоторых экспериментов, связанных с pH и NaCl, где эти атрибуты являются переменными в изучать).28 Список различных условий обобщен в таблице 1. Эксперимент, отмеченный †, используется в качестве эталона и соответствует образцу, содержащему 10 мМ NaCl и pH 7,2.
Линия клеток рака простаты человека (DU145) и иммортализованные кератиноциты человека (HaCaT) были получены от ATCC (Манассас, Вирджиния, США).Клетки обычно культивируют в минимально необходимой среде Дульбекко Eagle (DMEM), содержащей 4,5 г/л глюкозы (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), с добавлением 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 0,01% стрептомицина и 0,005% Пенициллин (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США).Клетки культивируют в инкубаторе с температурой 37°C, в атмосфере 5% CO2 и влажности 95%.
Чтобы изучить изменения цитотоксичности AgNP, вызванные агрегацией частиц во времени, был проведен двухэтапный МТТ-анализ.Сначала измеряли жизнеспособность двух типов клеток после обработки AgNP-I, AgNP-II и AgNP-III.С этой целью два типа клеток высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 10 000 клеток на лунку и обрабатывали наночастицами серебра трех разных размеров в возрастающих концентрациях на второй день.После 24 часов обработки клетки промывали PBS и инкубировали с 0,5 мг/мл реагента МТТ (SERVA, Гейдельберг, Германия), разведенного в культуральной среде, в течение 1 часа при 37°C.Кристаллы формазана растворяли в ДМСО (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и измеряли поглощение при 570 нм с использованием планшет-ридера Synergy HTX (BioTek-Венгрия, Будапешт, Венгрия).Показатель абсорбции необработанного контрольного образца считается 100%-ной выживаемостью.Выполните не менее 3 экспериментов, используя четыре независимых биологических повтора.IC50 рассчитывается по кривой доза-эффект, основанной на результатах жизнеспособности.
После этого, на втором этапе, путем инкубации частиц с 150 мМ NaCl в течение разных периодов времени (0, 1,5, 3, 6, 12 и 24 часа) перед обработкой клеток были получены различные агрегатные состояния наночастиц серебра.Впоследствии был проведен тот же МТТ-анализ, как описано ранее, для оценки изменений жизнеспособности клеток, на которые влияет агрегация частиц.Используйте GraphPad Prism 7, чтобы оценить окончательный результат, рассчитать статистическую значимость эксперимента с помощью непарного t-критерия и отметить его уровень как * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01), *** (p ≤ 0,001). ) и **** (р ≤ 0,0001).
Наночастицы серебра трех разных размеров (AgNP-I, AgNP-II и AgNP-III) использовались для определения антибактериальной чувствительности к Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM; Исследовательский центр патогенных грибов и микробной токсикологии, Университет Тиба) и Bacillus Test megaterium SZMC 6031. (SZMC: Сегедская микробиологическая коллекция) и E. coli SZMC 0582 в среде RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Co.).Чтобы оценить изменения антибактериальной активности, вызванные агрегацией частиц, сначала определяли их минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) путем микроразведения в 96-луночном микротитровальном планшете.К 50 мкл стандартизированной клеточной суспензии (5 × 104 клеток/мл в среде RPMI 1640) добавляют 50 мкл суспензии наночастиц серебра и серийно разводят двойную концентрацию (в вышеупомянутой среде диапазон составляет 0 и 75 ppm, т.е. контрольный образец содержит 50 мкл клеточной суспензии и 50 мкл среды без наночастиц).После этого планшет инкубировали при 30°C в течение 48 часов и измеряли оптическую плотность культуры при длине волны 620 нм с использованием планшет-ридера SPECTROstar Nano (BMG LabTech, Оффенбург, Германия).Эксперимент проводился трижды в трехкратной повторности.
За исключением того, что в этот раз использовали 50 мкл образцов одиночных агрегированных наночастиц, ту же процедуру, что описана ранее, использовали для изучения влияния агрегации на антибактериальную активность вышеупомянутых штаммов.Различные агрегатные состояния наночастиц серебра создаются путем инкубации частиц с 150 мМ NaCl в течение разных периодов времени (0, 1,5, 3, 6, 12 и 24 часа) перед обработкой клеток.В качестве контроля роста использовали суспензию с 50 мкл среды RPMI 1640, а для контроля токсичности – суспензию с неагрегированными наночастицами.Эксперимент проводился трижды в трехкратной повторности.Используйте GraphPad Prism 7, чтобы еще раз оценить окончательный результат, используя тот же статистический анализ, что и анализ MTT.
Уровень агрегации мельчайших частиц (AgNP-I) охарактеризован, результаты частично опубликованы в нашей предыдущей работе, но для лучшего сравнения все частицы были тщательно проверены.Экспериментальные данные собраны и обсуждаются в следующих разделах.Три размера AgNP.19
Измерения, выполненные с помощью TEM, UV-Vis и DLS, подтвердили успешный синтез всех образцов AgNP (рис. 2A-D).Согласно первому ряду рисунка 2, самая маленькая частица (AgNP-I) имеет однородную сферическую морфологию со средним диаметром около 10 нм.Метод выращивания с помощью затравки также обеспечивает AgNP-II и AgNP-III с различными диапазонами размеров со средним диаметром частиц примерно 20 нм и 50 нм соответственно.По стандартному отклонению распределения частиц размеры трех образцов не перекрываются, что важно для их сравнительного анализа.Сравнивая среднее соотношение сторон и коэффициент тонкости 2D-проекций частиц на основе TEM, предполагается, что сферичность частиц оценивается подключаемым модулем фильтра формы ImageJ (рис. 2E).43 Согласно анализу формы частиц, их соотношение сторон (большая сторона/короткая сторона наименьшего ограничивающего прямоугольника) не зависит от роста частиц, а коэффициент их тонкости (измеренная площадь соответствующего идеального круга/теоретическая площадь) ) постепенно уменьшается.В результате появляется все больше и больше многогранных частиц, которые теоретически являются идеально круглыми, что соответствует коэффициенту тонкости, равному 1.
Рисунок 2. Изображение, полученное с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ТЕМ) (А), картина электронной дифракции (ЭД) (Б), гистограмма распределения по размерам (С), характерный спектр поглощения ультрафиолетового и видимого света (УФ-Вид) (D) и среднее значение цитрата жидкости. Наночастицы серебра с концевыми группами с механическим диаметром (Z-среднее), дзета-потенциалом, соотношением сторон и соотношением толщины (E) имеют три различных диапазона размеров: AgNP-I составляет 10 нм (верхний ряд), AgNP-II составляет 20 нм (средний ряд). ), AgNP-III (нижний ряд) – 50 нм.
Хотя циклический характер метода выращивания в некоторой степени повлиял на форму частиц, что привело к меньшей сферичности более крупных AgNP, все три образца остались квазисферическими.Кроме того, как показано на картине дифракции электронов на рисунке 2B, нанокристалличность частиц не изменяется.Выступающее дифракционное кольцо, которое можно соотнести с индексами Миллера серебра (111), (220), (200) и (311), очень согласуется с данными научной литературы и нашими предыдущими работами.9, 19,44 Фрагментация кольца Дебая-Шеррера AgNP-II и AgNP-III обусловлена ​​тем, что ЭД-изображение захватывается при одинаковом увеличении, поэтому с увеличением размера частиц число дифрагированных частиц на единицу Площадь единицы увеличивается и уменьшается.
Известно, что размер и форма наночастиц влияют на биологическую активность.3,45 Зависимая от формы каталитическая и биологическая активность может быть объяснена тем фактом, что разные формы имеют тенденцию к увеличению определенных граней кристаллов (имеющих разные индексы Миллера), и эти грани кристаллов обладают разной активностью.45,46 Поскольку приготовленные частицы дают схожие результаты ЭД, соответствующие очень похожим кристаллическим характеристикам, можно предположить, что в наших последующих экспериментах по коллоидной стабильности и биологической активности любые наблюдаемые различия следует отнести к размеру наночастиц, а не к свойствам, связанным с формой.
Результаты УФ-Вид, представленные на рисунке 2D, еще раз подчеркивают подавляющую сферическую природу синтезированных AgNP, поскольку пики SPR всех трех образцов составляют около 400 нм, что является характерным значением для сферических наночастиц серебра.29,30 Полученные спектры также подтвердили успешный рост наносеребра с помощью семян.По мере увеличения размера частиц длина волны, соответствующая максимальному поглощению света AgNP-II, более заметна. Согласно литературным данным, AgNP-III испытывает красное смещение.6,29
Что касается начальной коллоидной стабильности системы AgNP, метод DLS использовался для измерения среднего гидродинамического диаметра и дзета-потенциала частиц при pH 7,2.Результаты, представленные на рисунке 2E, показывают, что AgNP-III имеет более высокую коллоидную стабильность, чем AgNP-I или AgNP-II, поскольку общие рекомендации указывают на то, что для долгосрочной коллоидной стабильности необходим дзета-потенциал 30 мВ абсолютного значения. Среднее значение Z (полученное как средний гидродинамический диаметр свободных и агрегированных частиц) сравнивается с размером первичных частиц, полученным с помощью ПЭМ, поскольку чем ближе эти два значения, тем мягче степень сбора в образце.Фактически, среднее значение Z AgNP-I и AgNP-II значительно выше, чем их основной размер частиц, оцененный с помощью ПЭМ, поэтому по сравнению с AgNP-III прогнозируется, что эти образцы с большей вероятностью будут агрегировать, где крайне отрицательный дзета-потенциал сопровождается близким размером среднего значения Z.
Объяснение этого явления может быть двояким.С одной стороны, концентрация цитрата поддерживается на одинаковом уровне на всех стадиях синтеза, обеспечивая относительно высокое количество заряженных поверхностных групп, чтобы предотвратить уменьшение удельной поверхности растущих частиц.Однако, по мнению Левака и др., небольшие молекулы, такие как цитрат, могут легко заменяться биомолекулами на поверхности наночастиц.В этом случае коллоидная стабильность будет определяться короной образующихся биомолекул.31 Поскольку такое поведение также наблюдалось в наших измерениях агрегации (подробнее обсуждается позже), одно только цитратное кэпирование не может объяснить это явление.
С другой стороны, размер частиц обратно пропорционален склонности к агрегации на нанометровом уровне.Это в основном подтверждается традиционным методом Дерягина-Ландау-Вервея-Овербика (DLVO), где притяжение частиц описывается как сумма сил притяжения и отталкивания между частицами.Согласно He et al., максимальное значение энергетической кривой DLVO уменьшается с размером наночастиц в наночастицах гематита, что облегчает достижение минимальной первичной энергии, тем самым способствуя необратимой агрегации (конденсации).47 Однако предполагается, что существуют и другие аспекты, выходящие за рамки ограничений теории DLVO.Хотя гравитация Ван-дер-Ваальса и электростатическое отталкивание двойного слоя схожи с увеличением размера частиц, обзор Hotze et al.предполагает, что это оказывает более сильное влияние на агрегацию, чем позволяет DLVO.14 Они полагают, что кривизну поверхности наночастиц больше нельзя оценивать как плоскую поверхность, что делает математическую оценку неприменимой.Кроме того, по мере уменьшения размера частиц процент атомов, присутствующих на поверхности, становится выше, что приводит к изменению электронной структуры и поведения поверхностного заряда.При этом изменяется реактивность поверхности, что может привести к уменьшению заряда в двойном электрическом слое и способствовать агрегации.
При сравнении результатов DLS AgNP-I, AgNP-II и AgNP-III на рисунке 3 мы заметили, что все три образца показали одинаковый pH, вызывающий агрегацию.Сильнокислая среда (pH 3) смещает дзета-потенциал образца до 0 мВ, заставляя частицы образовывать агрегаты микронного размера, тогда как щелочной pH смещает его дзета-потенциал в сторону более отрицательного значения, при котором частицы образуют более мелкие агрегаты (pH 5). ).И 7,2)), либо остаются полностью неагрегированными (рН 9).Также наблюдались некоторые важные различия между разными образцами.На протяжении всего эксперимента AgNP-I оказался наиболее чувствительным к изменениям дзета-потенциала, вызванным pH, поскольку дзета-потенциал этих частиц был снижен при pH 7,2 по сравнению с pH 9, в то время как AgNP-II и AgNP-III показали только A значительное изменение ζ происходит около pH 3. Кроме того, AgNP-II показал более медленные изменения и умеренный дзета-потенциал, тогда как AgNP-III продемонстрировал самое мягкое поведение из трех, поскольку система показала самое высокое абсолютное значение дзета и медленное движение тренда, что указывает на AgNP-III Наиболее устойчив к агрегации, вызванной pH.Эти результаты согласуются с результатами измерения среднего гидродинамического диаметра.Учитывая размер частиц их праймеров, AgNP-I демонстрировал постоянную постепенную агрегацию при всех значениях pH, скорее всего, из-за фона 10 мМ NaCl, тогда как AgNP-II и AgNP-III демонстрировали значительную агрегацию только при pH 3 Of.Самое интересное отличие заключается в том, что, несмотря на большой размер наночастиц, AgNP-III образует самые мелкие агрегаты при pH 3 за 24 часа, что подчеркивает его антиагрегационные свойства.Разделив среднее значение Z AgNP при pH 3 через 24 часа на значение приготовленного образца, можно заметить, что относительные размеры агрегатов AgNP-I и AgNP-II увеличились в 50, 42 и 22 раза. , соответственно.III.
Рисунок 3. Результаты динамического светорассеяния образца наночастиц серебра с цитратными концевыми группами увеличивающегося размера (10 нм: AgNP-I, 20 нм: AgNP-II и 50 нм: AgNP-III) выражены как средний гидродинамический диаметр (Z среднее значение). ) (справа) При различных условиях pH зета-потенциал (слева) меняется в течение 24 часов.
Наблюдаемая pH-зависимая агрегация также повлияла на характерный поверхностный плазмонный резонанс (ППР) образцов AgNP, о чем свидетельствуют их УФ-видимые спектры.Согласно дополнительному рисунку S1, агрегация всех трех суспензий наночастиц серебра сопровождается снижением интенсивности их пиков ППР и умеренным красным смещением.Степень этих изменений в зависимости от pH соответствует степени агрегации, предсказанной результатами DLS, однако наблюдались некоторые интересные тенденции.Вопреки интуиции оказывается, что AgNP-II среднего размера наиболее чувствителен к изменениям ППР, тогда как два других образца менее чувствительны.В исследованиях ППР 50 нм — это теоретический предел размера частиц, который используется для различения частиц на основе их диэлектрических свойств.Частицы размером менее 50 нм (AgNP-I и AgNP-II) можно охарактеризовать как простые диэлектрические диполи, тогда как частицы, достигающие или превышающие этот предел (AgNP-III), имеют более сложные диэлектрические свойства, и их резонанс. Полоса распадается на мультимодальные изменения. .В случае двух образцов частиц меньшего размера AgNP можно рассматривать как простые диполи, и плазма может легко перекрываться.По мере увеличения размера частиц это взаимодействие по существу создает более крупную плазму, что может объяснить наблюдаемую более высокую чувствительность.29 Однако для самых крупных частиц простая оценка диполя недействительна, когда могут возникать и другие состояния связи, что может объяснить снижение склонности AgNP-III указывать на спектральные изменения.29
В наших экспериментальных условиях доказано, что значение pH оказывает глубокое влияние на коллоидную стабильность покрытых цитратом наночастиц серебра различных размеров.В этих системах стабильность обеспечивают отрицательно заряженные группы -СОО- на поверхности AgНЧ.Карбоксилатная функциональная группа цитрат-иона протонирована в большом количестве ионов H+, поэтому образующаяся карбоксильная группа больше не может обеспечивать электростатическое отталкивание между частицами, как показано в верхнем ряду рисунка 4. Согласно принципу Ле Шателье, AgNP образцы быстро агрегируют при pH 3, но постепенно становятся все более стабильными по мере увеличения pH.
Рисунок 4. Схематический механизм поверхностного взаимодействия, определяемый агрегацией при различных значениях pH (верхний ряд), концентрации NaCl (средний ряд) и биомолекул (нижний ряд).
Согласно рисунку 5, коллоидная стабильность суспензий AgNP разных размеров также была исследована при повышении концентрации соли.Судя по дзета-потенциалу, увеличенный размер наночастиц в этих системах AgNP с цитратными концевыми группами снова обеспечивает повышенную устойчивость к внешним воздействиям со стороны NaCl.В AgNP-I 10 мМ NaCl достаточно, чтобы вызвать легкую агрегацию, а концентрация соли 50 мМ дает очень похожие результаты.В AgNP-II и AgNP-III 10 мМ NaCl существенно не влияет на дзета-потенциал, поскольку их значения остаются на уровне (AgNP-II) или ниже (AgNP-III) -30 мВ.Увеличение концентрации NaCl до 50 мМ и, наконец, до 150 мМ NaCl достаточно, чтобы существенно снизить абсолютное значение дзета-потенциала во всех образцах, хотя более крупные частицы сохраняют больший отрицательный заряд.Эти результаты согласуются с ожидаемым средним гидродинамическим диаметром AgNP;линии тренда Z среднего, измеренные для 10, 50 и 150 мМ NaCl, показывают разные, постепенно увеличивающиеся значения.Наконец, во всех трех экспериментах с концентрацией 150 мМ были обнаружены агрегаты микронного размера.
Рисунок 5. Результаты динамического светорассеяния образца наночастиц серебра с цитратными концевыми группами увеличивающегося размера (10 нм: AgNP-I, 20 нм: AgNP-II и 50 нм: AgNP-III) выражены как средний гидродинамический диаметр (Z среднее значение). ) (справа) и зета-потенциал (слева) изменяются в течение 24 часов при различных концентрациях NaCl.
Результаты УФ-Вид на дополнительном рисунке S2 показывают, что SPR 50 и 150 мМ NaCl во всех трех образцах имеет мгновенное и значительное снижение.Это можно объяснить ДРС, поскольку агрегация на основе NaCl происходит быстрее, чем в экспериментах, зависящих от pH, что объясняется большой разницей между ранними (0, 1,5 и 3 часа) измерениями.Кроме того, увеличение концентрации соли также приведет к увеличению относительной диэлектрической проницаемости экспериментальной среды, что окажет глубокое влияние на поверхностный плазмонный резонанс.29
Влияние NaCl суммировано в среднем ряду рисунка 4. В целом можно сделать вывод, что увеличение концентрации хлорида натрия имеет эффект, аналогичный увеличению кислотности, поскольку ионы Na+ имеют тенденцию координироваться вокруг карбоксилатных групп, подавление отрицательного дзета-потенциала AgNP.Кроме того, 150 мМ NaCl образовывал агрегаты микронного размера во всех трех образцах, что указывает на то, что физиологическая концентрация электролита вредна для коллоидной стабильности AgNP с цитратными концевыми группами.Учитывая критическую концентрацию конденсации (CCC) NaCl в аналогичных системах AgNP, эти результаты можно разумно поместить в соответствующую литературу.Хьюнь и др.подсчитали, что CCC NaCl для наночастиц серебра с цитратными концевыми группами со средним диаметром 71 нм составила 47,6 мМ, а El Badawy et al.наблюдали, что CCC AgNP размером 10 нм с цитратным покрытием составляла 70 мМ.10,16 Кроме того, He et al. измерили значительно высокий CCC, составляющий около 300 мМ, что привело к тому, что их метод синтеза отличался от ранее упомянутой публикации.48 Хотя текущий вклад не направлен на всесторонний анализ этих значений, поскольку наши экспериментальные условия усложняются по мере усложнения всего исследования, биологически значимая концентрация NaCl 50 мМ, особенно 150 мМ NaCl, кажется довольно высокой.Индуцированная коагуляция, объясняющая обнаруженные сильные изменения.
Следующим шагом в эксперименте по полимеризации является использование простых, но биологически значимых молекул для моделирования взаимодействий наночастиц и биомолекул.На основании результатов DLS (рис. 6 и 7) и УФ-Вид (дополнительные рисунки S3 и S4) можно сделать некоторые общие выводы.В наших экспериментальных условиях изученные молекулы глюкозы и глутамина не будут вызывать агрегацию ни в одной системе AgNP, поскольку тренд Z-mean тесно связан с соответствующим эталонным значением измерения.Хотя их присутствие не влияет на агрегацию, экспериментальные результаты показывают, что эти молекулы частично адсорбируются на поверхности AgНЧ.Наиболее заметным результатом, подтверждающим эту точку зрения, является наблюдаемое изменение поглощения света.Хотя AgNP-I не демонстрирует значительных изменений длины волны или интенсивности, его можно наблюдать более четко при измерении более крупных частиц, что, скорее всего, связано с большей оптической чувствительностью, упомянутой ранее.Независимо от концентрации глюкоза может вызвать большее красное смещение через 1,5 часа по сравнению с контрольным измерением, которое составляет около 40 нм в AgNP-II и около 10 нм в AgNP-III, что доказывает возникновение поверхностных взаимодействий.Глутамин продемонстрировал аналогичную тенденцию, но изменения были не столь очевидными.Кроме того, стоит также отметить, что глутамин может снижать абсолютный зета-потенциал средних и крупных частиц.Однако, поскольку эти дзета-изменения, по-видимому, не влияют на уровень агрегации, можно предположить, что даже небольшие биомолекулы, такие как глутамин, могут обеспечивать определенную степень пространственного отталкивания между частицами.
Рисунок 6. Результаты динамического светорассеяния образцов наночастиц серебра с цитратными концевыми группами увеличивающегося размера (10 нм: AgNP-I, 20 нм: AgNP-II и 50 нм: AgNP-III) выражены как средний гидродинамический диаметр (Z-среднее). (справа) При внешних условиях различной концентрации глюкозы зета-потенциал (слева) изменяется в течение 24 часов.
Рисунок 7. Результаты динамического светорассеяния образца наночастиц серебра с цитратными концевыми группами увеличивающегося размера (10 нм: AgNP-I, 20 нм: AgNP-II и 50 нм: AgNP-III) выражены как средний гидродинамический диаметр (Z среднее значение). ) (справа) В присутствии глютамина зета-потенциал (слева) изменяется в течение 24 часов.
Короче говоря, небольшие биомолекулы, такие как глюкоза и глютамин, не влияют на коллоидную стабильность при измеренной концентрации: хотя они в разной степени влияют на зета-потенциал и результаты УФ-ВИД, средние результаты Z не являются последовательными.Это указывает на то, что поверхностная адсорбция молекул подавляет электростатическое отталкивание, но в то же время обеспечивает стабильность размеров.
Чтобы связать предыдущие результаты с предыдущими результатами и более умело смоделировать биологические условия, мы выбрали некоторые из наиболее часто используемых компонентов клеточной культуры и использовали их в качестве экспериментальных условий для изучения стабильности коллоидов AgNP.Во всем эксперименте in vitro одной из важнейших функций DMEM как среды является создание необходимых осмотических условий, однако с химической точки зрения это сложный солевой раствор с общей ионной силой, близкой к 150 мМ NaCl. .40 Что касается ФБС, то она представляет собой сложную смесь биомолекул, преимущественно белков, с точки зрения поверхностной адсорбции, она имеет некоторое сходство с экспериментальными результатами по глюкозе и глютамину, несмотря на химический состав и разнообразие. Пол значительно сложнее.19 DLS и УФ-видимые результаты, показанные на рисунке 8 и дополнительном рисунке S5 соответственно, можно объяснить, исследуя химический состав этих материалов и сопоставляя их с измерениями в предыдущем разделе.
Рисунок 8. Результаты динамического светорассеяния образца наночастиц серебра с цитратными концевыми группами увеличивающегося размера (10 нм: AgNP-I, 20 нм: AgNP-II и 50 нм: AgNP-III) выражены как средний гидродинамический диаметр (Z среднее значение). ) (справа) В присутствии компонентов культуры клеток DMEM и FBS зета-потенциал (слева) изменяется в течение 24 часов.
Разбавление AgNP разного размера в DMEM оказывает на коллоидную стабильность такое же влияние, как и в присутствии высоких концентраций NaCl.Дисперсия AgNP в 50 об/об% DMEM показала, что крупномасштабная агрегация обнаруживалась при увеличении дзета-потенциала и Z-среднего значения и резком снижении интенсивности SPR.Стоит отметить, что максимальный размер агрегатов, индуцированный DMEM через 24 часа, обратно пропорционален размеру наночастиц праймера.
Взаимодействие между FBS и AgNP аналогично тому, которое наблюдается в присутствии более мелких молекул, таких как глюкоза и глютамин, но эффект сильнее.Среднее значение Z частиц остается неизменным, в то время как обнаруживается увеличение дзета-потенциала.Пик SPR показал небольшое красное смещение, но, что, возможно, более интересно, интенсивность SPR не снизилась так значительно, как при контрольном измерении.Эти результаты можно объяснить врожденной адсорбцией макромолекул на поверхности наночастиц (нижний ряд на рисунке 4), которую сейчас понимают как образование биомолекулярной короны в организме.49