Javascript je momentálne vo vašom prehliadači zakázaný.Keď je javascript zakázaný, niektoré funkcie tejto webovej stránky nebudú fungovať.
Zaregistrujte svoje špecifické údaje a konkrétne drogy, ktoré vás zaujímajú, a my vám poskytnuté informácie spojíme s článkami v našej rozsiahlej databáze a včas vám pošleme kópiu PDF e-mailom.
Sú menšie nanočastice vždy lepšie?Pochopte biologické účinky agregácie nanočastíc striebra v závislosti od veľkosti za biologicky relevantných podmienok
Autori: Bélteky P, Rónavári A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Kónya Z
Péter Bélteky,1,* Andrea Rónavári,1,* Dalma Zakupszky,1 Eszter Boka,1 Nóra Igaz,2 Bettina Szerencsés,3 Ilona Pfeiffer,3 Csaba Vágvölgyi,3 Mónika Kiricsi z chémie životného prostredia, Maďarsko, Maďarsko Fakulta vedy a informatiky , Univerzita v Szegede;2 Katedra biochémie a molekulárnej biológie, Fakulta vedy a informácií, Univerzita v Szegede, Maďarsko;3 Katedra mikrobiológie, Fakulta vedy a informácií, Univerzita v Szegede, Maďarsko;4MTA-SZTE Reaction Kinetics and Surface Chemistry Research Group, Szeged, Maďarsko* Títo autori prispeli k tejto práci rovnakým dielom.Komunikácia: Zoltán Kónya Katedra aplikovanej a environmentálnej chémie, Fakulta vedy a informatiky, Univerzita v Szegede, Rerrichovo námestie 1, Szeged, H-6720, Maďarsko Telefón +36 62 544620 Email [Ochrana e-mailu] Účel: Nanočastice striebra (AgNP) sú jeden z najčastejšie študovaných nanomateriálov, najmä vďaka ich biomedicínskym aplikáciám.V dôsledku agregácie nanočastíc je však v biologických médiách často ohrozená ich vynikajúca cytotoxicita a antibakteriálna aktivita.V tejto práci sa študovalo agregačné správanie a súvisiace biologické aktivity troch rôznych vzoriek nanočastíc striebra zakončených citrátom s priemerným priemerom 10, 20 a 50 nm.Metóda: Pomocou transmisného elektrónového mikroskopu syntetizujte a charakterizujte nanočastice, vyhodnoťte ich agregačné správanie pri rôznych hodnotách pH, ​​koncentráciách NaCl, glukózy a glutamínu dynamickým rozptylom svetla a ultrafialovou spektroskopiou.Okrem toho zložky kultivačného média, ako je Dulbecco, zlepšujú agregačné správanie v médiu Eagle a fetálnom teľacom sére.Výsledky: Výsledky ukazujú, že kyslé pH a fyziologický obsah elektrolytov vo všeobecnosti vyvolávajú agregáciu v mikrónovom meradle, ktorá môže byť sprostredkovaná tvorbou biomolekulovej koróny.Stojí za zmienku, že väčšie častice vykazujú vyššiu odolnosť voči vonkajším vplyvom ako ich menšie náprotivky.In vitro testy cytotoxicity a antibakteriálne testy sa uskutočnili ošetrením buniek agregátmi nanočastíc v rôznych štádiách agregácie.Záver: Naše výsledky odhaľujú hlbokú koreláciu medzi koloidnou stabilitou a toxicitou AgNP, pretože extrémna agregácia vedie k úplnej strate biologickej aktivity.Vyšší stupeň antiagregácie pozorovaný u väčších častíc má významný vplyv na toxicitu in vitro, pretože takéto vzorky si zachovávajú väčšiu antimikrobiálnu aktivitu a aktivitu cicavčích buniek.Tieto zistenia vedú k záveru, že napriek všeobecnému názoru v príslušnej literatúre nemusí byť zacielenie na najmenšie možné nanočastice tým najlepším postupom.Kľúčové slová: rast sprostredkovaný semenami, koloidná stabilita, agregačné správanie závislé od veľkosti, toxicita poškodenia agregáciou
Keďže dopyt po nanomateriáloch a ich produkcia neustále narastajú, čoraz viac pozornosti sa venuje ich biologickej bezpečnosti alebo biologickej aktivite.Nanočastice striebra (AgNP) sú jedným z najčastejšie syntetizovaných, skúmaných a využívaných zástupcov tejto triedy materiálov pre ich vynikajúce katalytické, optické a biologické vlastnosti.1 Všeobecne sa verí, že jedinečné vlastnosti nanomateriálov (vrátane AgNP) sa pripisujú najmä ich veľkému špecifickému povrchu.Nevyhnutným problémom je preto akýkoľvek proces, ktorý ovplyvňuje túto kľúčovú vlastnosť, ako je veľkosť častíc, povrchová úprava alebo agregácia, či vážne poškodí vlastnosti nanočastíc, ktoré sú kritické pre konkrétne aplikácie.
Účinky veľkosti častíc a stabilizátorov sú témy, ktoré sú pomerne dobre zdokumentované v literatúre.Napríklad všeobecne akceptovaný názor je, že menšie nanočastice sú toxickejšie ako väčšie nanočastice.2 V súlade so všeobecnou literatúrou naše predchádzajúce štúdie preukázali aktivitu nanostriebra na bunky cicavcov a mikroorganizmy závislú od veľkosti.3– 5 Povrchová úprava je ďalším atribútom, ktorý má široký vplyv na vlastnosti nanomateriálov.Len pridaním alebo úpravou stabilizátorov na svojom povrchu môže mať ten istý nanomateriál úplne odlišné fyzikálne, chemické a biologické vlastnosti.Aplikácia uzatváracích činidiel sa najčastejšie vykonáva v rámci syntézy nanočastíc.Napríklad nanočastice striebra zakončené citrátom sú jedným z najdôležitejších AgNP vo výskume, ktoré sa syntetizujú redukciou solí striebra vo vybranom roztoku stabilizátora ako reakčného média.6 Citrát môže ľahko využiť svoju nízku cenu, dostupnosť, biokompatibilitu a silnú afinitu k striebru, čo sa môže prejaviť v rôznych navrhovaných interakciách, od reverzibilnej povrchovej adsorpcie až po iónové interakcie.Malé molekuly a polyatomické ióny blízke 7,8, ako sú citráty, polyméry, polyelektrolyty a biologické činidlá, sa tiež bežne používajú na stabilizáciu nano-striebra a na vykonávanie jedinečných funkcionalizácií.9-12
Aj keď je možnosť zmeny aktivity nanočastíc zámerným zakrývaním povrchu veľmi zaujímavou oblasťou, hlavná úloha tohto povrchového povlaku je zanedbateľná, pretože poskytuje koloidnú stabilitu systému nanočastíc.Veľký špecifický povrch nanomateriálov bude produkovať veľkú povrchovú energiu, ktorá bráni termodynamickej schopnosti systému dosiahnuť minimálnu energiu.13 Bez náležitej stabilizácie to môže viesť k aglomerácii nanomateriálov.Agregácia je vytváranie zhlukov častíc rôznych tvarov a veľkostí, ku ktorým dochádza, keď sa stretnú dispergované častice a súčasné termodynamické interakcie umožňujú časticiam priľnúť k sebe.Preto sa stabilizátory používajú na zabránenie agregácie zavedením dostatočne veľkej odpudivej sily medzi častice, aby pôsobili proti ich termodynamickej príťažlivosti.14
Hoci téma veľkosti častíc a povrchového pokrytia bola dôkladne preskúmaná v kontexte jej regulácie biologických aktivít spúšťaných nanočasticami, agregácia častíc je do značnej miery zanedbávanou oblasťou.Neexistuje takmer žiadna dôkladná štúdia na vyriešenie koloidnej stability nanočastíc za biologicky relevantných podmienok.10,15-17 Okrem toho je tento príspevok obzvlášť vzácny tam, kde sa skúmala aj toxicita spojená s agregáciou, aj keď môže spôsobiť nežiaduce reakcie, ako je vaskulárna trombóza, alebo stratu požadovaných vlastností, ako je jeho toxicita, napr. znázornené na obrázku 1.18, 19 znázornené.V skutočnosti jeden z mála známych mechanizmov rezistencie na nanočastice striebra súvisí s agregáciou, pretože sa uvádza, že určité kmene E. coli a Pseudomonas aeruginosa znižujú svoju citlivosť na nano-striebro expresiou proteínového bičíka, bičíka.Má vysokú afinitu k striebru, čím vyvoláva agregáciu.20
Existuje niekoľko rôznych mechanizmov súvisiacich s toxicitou nanočastíc striebra a agregácia ovplyvňuje všetky tieto mechanizmy.Najdiskutovanejšia metóda biologickej aktivity AgNP, niekedy označovaná ako mechanizmus „trójskeho koňa“, považuje AgNP za nosiče Ag+.1,21 Mechanizmus trójskeho koňa dokáže zabezpečiť veľké zvýšenie lokálnej koncentrácie Ag+, čo vedie k tvorbe ROS a depolarizácii membrány.22-24 Agregácia môže ovplyvniť uvoľňovanie Ag+, a tým ovplyvniť toxicitu, pretože znižuje účinný aktívny povrch, na ktorom môžu byť ióny striebra oxidované a rozpustené.AgNP však nebudú vykazovať toxicitu len prostredníctvom uvoľňovania iónov.Musí sa zvážiť veľa interakcií súvisiacich s veľkosťou a morfológiou.Medzi nimi sú určujúcimi charakteristikami veľkosť a tvar povrchu nanočastíc.4,25 Súbor týchto mechanizmov možno kategorizovať ako „mechanizmy indukovanej toxicity“.Existuje potenciálne veľa mitochondriálnych a povrchových membránových reakcií, ktoré môžu poškodiť organely a spôsobiť bunkovú smrť.25-27 Keďže tvorba agregátov prirodzene ovplyvňuje veľkosť a tvar predmetov obsahujúcich striebro rozpoznávaných živými systémami, môžu byť ovplyvnené aj tieto interakcie.
V našom predchádzajúcom článku o agregácii nanočastíc striebra sme demonštrovali účinný skríningový postup pozostávajúci z chemických a in vitro biologických experimentov na štúdium tohto problému.19 Dynamický rozptyl svetla (DLS) je preferovanou technikou pre tieto typy inšpekcií, pretože materiál môže rozptyľovať fotóny na vlnovej dĺžke porovnateľnej s veľkosťou jeho častíc.Pretože Brownova rýchlosť pohybu častíc v kvapalnom médiu súvisí s veľkosťou, zmena intenzity rozptýleného svetla sa môže použiť na určenie priemerného hydrodynamického priemeru (Z-priemer) kvapalnej vzorky.28 Okrem toho privedením napätia na vzorku možno zeta potenciál (ζ potenciál) nanočastice merať podobne ako priemernú hodnotu Z.13,28 Ak je absolútna hodnota zeta potenciálu dostatočne vysoká (podľa všeobecných smerníc > ±30 mV), vytvorí sa silné elektrostatické odpudzovanie medzi časticami, aby sa pôsobilo proti agregácii.Charakteristická povrchová plazmónová rezonancia (SPR) je jedinečný optický jav, ktorý sa pripisuje najmä nanočasticiam drahých kovov (hlavne Au a Ag).29​​ Na základe elektronických oscilácií (povrchových plazmónov) týchto materiálov v nanoúrovni je známe, že sférické AgNP majú charakteristický UV-Vis absorpčný vrchol blízko 400 nm.30 Na doplnenie výsledkov DLS sa používa intenzita a posun vlnovej dĺžky častíc, pretože túto metódu možno použiť na detekciu agregácie nanočastíc a povrchovej adsorpcie biomolekúl.
Na základe získaných informácií sa uskutočňujú testy viability buniek (MTT) a antibakteriálne testy spôsobom, v ktorom je toxicita AgNP opísaná ako funkcia úrovne agregácie, a nie koncentrácie nanočastíc (najčastejšie používaného faktora).Táto jedinečná metóda nám umožňuje demonštrovať hlboký význam úrovne agregácie v biologickej aktivite, pretože napríklad AgNP zakončené citrátom úplne strácajú svoju biologickú aktivitu v priebehu niekoľkých hodín v dôsledku agregácie.19
V súčasnej práci sa snažíme výrazne rozšíriť naše predchádzajúce príspevky v oblasti stability bio-príbuzných koloidov a ich vplyvu na biologickú aktivitu štúdiom vplyvu veľkosti nanočastíc na agregáciu nanočastíc.Toto je nepochybne jedna zo štúdií nanočastíc.Perspektíva vyššieho profilu a 31 Na preskúmanie tohto problému sa použila metóda rastu sprostredkovaného semenami na produkciu AgNP zakončených citrátom v troch rôznych rozsahoch veľkosti (10, 20 a 50 nm).6,32 ako jedna z najbežnejších metód.Pre nanomateriály, ktoré sa široko a rutinne používajú v lekárskych aplikáciách, sa vyberajú AgNP zakončené citrátom rôznych veľkostí, aby sa študovala možná závislosť od veľkosti biologických vlastností nanostriebra súvisiacich s agregáciou.Po syntéze AgNP rôznych veľkostí sme vyrobené vzorky charakterizovali transmisnou elektrónovou mikroskopiou (TEM) a potom skúmali častice pomocou vyššie uvedeného skríningového postupu.Okrem toho v prítomnosti in vitro bunkových kultúr Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) a Fetal Bovine Serum (FBS) sa hodnotilo agregačné správanie závislé od veľkosti a jeho správanie pri rôznych hodnotách pH, ​​koncentráciách NaCl, glukózy a glutamínu.Charakteristiky cytotoxicity sa stanovujú za komplexných podmienok.Vedecký konsenzus naznačuje, že vo všeobecnosti sú vhodnejšie menšie častice;naše vyšetrovanie poskytuje chemickú a biologickú platformu na určenie, či je to tak.
Tri nanočastice striebra s rôznymi rozsahmi veľkostí boli pripravené metódou rastu sprostredkovaného semenami, ktorú navrhli Wan et al., s miernymi úpravami.6 Táto metóda je založená na chemickej redukcii s použitím dusičnanu strieborného (AgNO3) ako zdroja striebra, borohydridu sodného (NaBH4) ako redukčného činidla a citranu sodného ako stabilizátora.Najprv pripravte 75 ml 9 mM vodného roztoku citrátu z dihydrátu citrátu sodného (Na3C6H5O7 x 2H20) a zahrejte na 70 °C.Potom sa do reakčného média pridali 2 ml 1 % hmotn./obj. roztoku AgN03 a potom sa do zmesi po kvapkách nalial čerstvo pripravený roztok borohydridu sodného (2 ml 0,1 % hmotn./obj.).Výsledná žltohnedá suspenzia sa udržiavala pri 70 °C za intenzívneho miešania počas 1 hodiny a potom sa ochladila na teplotu miestnosti.Výsledná vzorka (odteraz označovaná ako AgNP-I) sa použije ako základ pre rast sprostredkovaný semenami v ďalšom kroku syntézy.
Na syntetizovanie suspenzie častíc strednej veľkosti (označenej ako AgNP-II) zahrejte 90 ml 7,6 mM roztoku citrátu na 80 °C, zmiešajte ho s 10 ml AgNP-I a potom primiešajte 2 ml 1 % w/v roztoku AgNO3 bola udržiavaná za intenzívneho mechanického miešania počas 1 hodiny a potom bola vzorka ochladená na teplotu miestnosti.
Pre najväčšiu časticu (AgNP-III) zopakujte rovnaký rastový proces, ale v tomto prípade použite 10 ml AgNP-II ako suspenziu semien.Keď vzorky dosiahli izbovú teplotu, nastavili svoju nominálnu koncentráciu Ag na základe celkového obsahu AgNO3 na 150 ppm pridaním alebo odparením ďalšieho rozpúšťadla pri 40 °C a nakoniec ich uskladnili pri 4 °C až do ďalšieho použitia.
Použite FEI Tecnai G2 20 X-Twin transmisný elektrónový mikroskop (TEM) (FEI Corporate Headquarters, Hillsboro, Oregon, USA) s akceleračným napätím 200 kV na skúmanie morfologických charakteristík nanočastíc a zachytenie ich elektrónového difraktogramu (ED).Najmenej 15 reprezentatívnych obrázkov (~ 750 častíc) bolo vyhodnotených pomocou softvérového balíka ImageJ a výsledné histogramy (a všetky grafy v celej štúdii) boli vytvorené v programe OriginPro 2018 (OriginLab, Northampton, MA, USA) 33, 34.
Priemerný hydrodynamický priemer (Z-priemer), zeta potenciál (Z-potenciál) a charakteristická povrchová plazmónová rezonancia (SPR) vzoriek boli merané na ilustráciu ich počiatočných koloidných vlastností.Priemerný hydrodynamický priemer a zeta potenciál vzorky sa merali prístrojom Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK) s použitím jednorazovo zložených kapilárnych buniek pri 37 ± 0,1 °C.Na získanie charakteristických SPR charakteristík z UV-Vis absorpčných spektier vzoriek v rozsahu 250-800 nm sa použil UV-Vis spektrofotometer Ocean Optics 355 DH-2000-BAL (Halma PLC, Largo, FL, USA).
Počas celého experimentu boli súčasne vykonávané tri rôzne typy meraní týkajúce sa koloidnej stability.Použite DLS na meranie priemerného hydrodynamického priemeru (priemer Z) a potenciálu zeta (potenciál ζ) častíc, pretože priemer Z súvisí s priemernou veľkosťou agregátov nanočastíc a potenciál zeta indikuje, či elektrostatické odpudzovanie v systéme je dostatočne silný na to, aby kompenzoval Van der Waalsovu príťažlivosť medzi nanočasticami.Merania sa uskutočnia trojmo a štandardná odchýlka Z priemeru a zeta potenciálu sa vypočíta pomocou softvéru Zetasizer.Charakteristické SPR spektrá častíc sú hodnotené UV-Vis spektroskopiou, pretože zmeny v intenzite vrcholu a vlnovej dĺžke môžu naznačovať agregáciu a povrchové interakcie.29,35 V skutočnosti je povrchová plazmónová rezonancia v drahých kovoch taká vplyvná, že viedla k novým metódam analýzy biomolekúl.29,36,37 Koncentrácia AgNP v experimentálnej zmesi je okolo 10 ppm a účelom je nastaviť intenzitu maximálnej počiatočnej absorpcie SPR na 1. Experiment sa uskutočnil časovo závislým spôsobom pri 0;1,5;3;6;12 a 24 hodín za rôznych biologicky relevantných podmienok.Viac podrobností o experimente je možné vidieť v našej predchádzajúcej práci.19 Stručne povedané, rôzne hodnoty pH (3; 5; 7,2 a 9), rôzne koncentrácie chloridu sodného (10 mM; 50 mM; 150 mM), glukózy (3,9 mM; 6,7 mM) a glutamínu (4 mM) a tiež pripravilo Dulbeccovo modifikované Eagle médium (DMEM) a fetálne bovinné sérum (FBS) (vo vode a DMEM) ako modelové systémy a študovali ich účinky na agregačné správanie syntetizovaných nanočastíc striebra.pH Hodnoty NaCl, glukózy a glutamínu sú hodnotené na základe fyziologických koncentrácií, pričom množstvá DMEM a FBS sú rovnaké ako hladiny použité v celom in vitro experimente.38-42 Všetky merania sa uskutočňovali pri pH 7,2 a 37 °C s konštantnou koncentráciou soli na pozadí 10 mM NaCl, aby sa eliminovali akékoľvek interakcie častíc na veľké vzdialenosti (okrem určitých experimentov s pH a NaCl, kde sú tieto atribúty premennými pod štúdium).28 Zoznam rôznych podmienok je zhrnutý v tabuľke 1. Experiment označený † sa používa ako referenčný a zodpovedá vzorke obsahujúcej 10 mM NaCl a pH 7,2.
Bunková línia ľudskej rakoviny prostaty (DU145) a imortalizované ľudské keratinocyty (HaCaT) boli získané z ATCC (Manassas, VA, USA).Bunky sa bežne kultivujú v Dulbeccovom minimálnom esenciálnom médiu Eagle (DMEM) obsahujúcom 4,5 g/l glukózy (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), doplnenom 10 % FBS, 2 mM L-glutamínom, 0,01 % streptomycínom a 0,005 % Penicilín (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA).Bunky sa kultivujú v inkubátore pri 37 °C pod 5 % C02 a 95 % vlhkosťou.
Aby sa preskúmali zmeny v cytotoxicite AgNP spôsobené agregáciou častíc spôsobom závislým od času, uskutočnil sa dvojkrokový test MTT.Najprv sa merala životaschopnosť týchto dvoch typov buniek po ošetrení AgNP-I, AgNP-II a AgNP-III.Na tento účel sa dva typy buniek naočkovali na 96-jamkové platne v hustote 10 000 buniek/jamku a na druhý deň sa ošetrili tromi rôznymi veľkosťami nanočastíc striebra vo zvyšujúcich sa koncentráciách.Po 24 hodinách pôsobenia boli bunky premyté PBS a inkubované s 0,5 mg/ml MTT činidlom (SERVA, Heidelberg, Nemecko) zriedeným v kultivačnom médiu počas 1 hodiny pri 37 °C.Kryštály formazanu sa rozpustili v DMSO (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) a absorpcia sa merala pri 570 nm pomocou čítačky doštičiek Synergy HTX (BioTek-Hungary, Budapešť, Maďarsko).Hodnota absorpcie neošetrenej kontrolnej vzorky sa považuje za 100 % mieru prežitia.Vykonajte aspoň 3 experimenty s použitím štyroch nezávislých biologických replikátov.IC50 sa vypočíta z krivky dávka-odpoveď na základe výsledkov vitality.
Potom, v druhom kroku, inkubáciou častíc so 150 mM NaCl počas rôznych časových období (0, 1,5, 3, 6, 12 a 24 hodín) pred ošetrením buniek, sa vytvorili rôzne stavy agregácie nanočastíc striebra.Následne sa uskutočnil rovnaký test MTT, ako bolo opísané vyššie, na vyhodnotenie zmien v životaschopnosti buniek ovplyvnených agregáciou častíc.Použite GraphPad Prism 7 na vyhodnotenie konečného výsledku, vypočítajte štatistickú významnosť experimentu nepárovým t-testom a označte jeho úroveň ako * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01), *** (p ≤ 0,001 ) A **** (p ≤ 0,0001).
Tri rôzne veľkosti nanočastíc striebra (AgNP-I, AgNP-II a AgNP-III) sa použili na antibakteriálnu citlivosť na Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM; Výskumné centrum pre patogénne huby a mikrobiálnu toxikológiu, Univerzita Chiba) a Bacillus Test megaterium SZMC 6031 (SZMC: Szeged Microbiology Collection) a E. coli SZMC 0582 v médiu RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Co.).Aby sa vyhodnotili zmeny v antibakteriálnej aktivite spôsobené agregáciou častíc, najprv sa stanovila ich minimálna inhibičná koncentrácia (MIC) mikroriedením v 96-jamkovej mikrotitračnej platni.Do 50 μl štandardizovanej bunkovej suspenzie (5 × 104 buniek/ml v médiu RPMI 1640) pridajte 50 μl suspenzie nanočastíc striebra a sériovo riedte dvojnásobnú koncentráciu (vo vyššie uvedenom médiu je rozsah 0 a 75 ppm, tj. kontrolná vzorka obsahuje 50 μl bunkovej suspenzie a 50 μl média bez nanočastíc).Potom sa doštička inkubovala pri 30 °C počas 48 hodín a optická hustota kultúry sa merala pri 620 nm pomocou čítačky platní SPECTROstar Nano (BMG LabTech, Offenburg, Nemecko).Experiment sa uskutočnil trikrát v troch vyhotoveniach.
Okrem toho, že sa v tomto čase použilo 50 μl jednotlivých agregovaných vzoriek nanočastíc, na skúmanie účinku agregácie na antibakteriálnu aktivitu na vyššie uvedené kmene sa použil rovnaký postup, ako bol opísaný vyššie.Rôzne stavy agregácie nanočastíc striebra sa vytvárajú inkubáciou častíc so 150 mM NaCl počas rôznych časových období (0, 1,5, 3, 6, 12 a 24 hodín) pred spracovaním buniek.Ako kontrola rastu sa použila suspenzia doplnená 50 ul média RPMI 1640, zatiaľ čo na kontrolu toxicity sa použila suspenzia s neagregovanými nanočasticami.Experiment sa uskutočnil trikrát v troch vyhotoveniach.Použite GraphPad Prism 7 na opätovné vyhodnotenie konečného výsledku s použitím rovnakej štatistickej analýzy ako pri MTT analýze.
Bola charakterizovaná úroveň agregácie najmenších častíc (AgNP-I) a výsledky boli čiastočne publikované v našej predchádzajúcej práci, ale pre lepšie porovnanie boli všetky častice dôkladne skrínované.Experimentálne údaje sú zhromaždené a diskutované v nasledujúcich častiach.Tri veľkosti AgNP.19
Merania uskutočnené pomocou TEM, UV-Vis a DLS overili úspešnú syntézu všetkých vzoriek AgNP (obrázok 2A-D).Podľa prvého radu na obrázku 2 vykazuje najmenšia častica (AgNP-I) jednotnú sférickú morfológiu so stredným priemerom približne 10 nm.Metóda rastu sprostredkovaného semenami tiež poskytuje AgNP-II a AgNP-III s rôznymi rozsahmi veľkostí so strednými priemermi častíc približne 20 nm a 50 nm.Podľa štandardnej odchýlky distribúcie častíc sa veľkosti troch vzoriek neprekrývajú, čo je dôležité pre ich porovnávaciu analýzu.Porovnaním priemerného pomeru strán a pomeru tenkosti častíc 2D projekcií založených na TEM sa predpokladá, že sférickosť častíc je hodnotená zásuvným modulom tvarového filtra ImageJ (obrázok 2E).43 Podľa analýzy tvaru častíc ich pomer strán (veľká strana/krátka strana najmenšieho ohraničujúceho obdĺžnika) nie je ovplyvnený rastom častíc a pomer ich tenkosti (nameraná plocha zodpovedajúceho dokonalého kruhu/teoretická plocha ) postupne klesá.Výsledkom je stále viac polyedrických častíc, ktoré sú teoreticky dokonale okrúhle, čo zodpovedá pomeru tenkosti 1.
Obrázok 2 Obrázok z transmisného elektrónového mikroskopu (TEM) (A), obrazec elektrónovej difrakcie (ED) (B), histogram distribúcie veľkosti (C), charakteristické spektrum absorpcie ultrafialového (UV-Vis) svetla (D) a priemerná kvapalina citrát -ukončené nanočastice striebra s mechanickým priemerom (Z-priemer), zeta potenciálom, pomerom strán a pomerom hrúbky (E) majú tri rôzne rozsahy veľkostí: AgNP-I je 10 nm (horný rad), AgNP -II je 20 nm (stredný riadok AgNP-III (spodný rad) je 50 nm.
Aj keď cyklická povaha metódy rastu do určitej miery ovplyvnila tvar častíc, čo malo za následok menšiu sférickosť väčších AgNP, všetky tri vzorky zostali kvázi sférické.Okrem toho, ako je znázornené na elektrónovom difraktograme na obrázku 2B, nano Kryštalinita častíc nie je ovplyvnená.Výrazný difrakčný kruh - ktorý možno korelovať s (111), (220), (200) a (311) Millerovými indexmi striebra - je veľmi konzistentný s vedeckou literatúrou a našimi predchádzajúcimi príspevkami.9, 19,44 Fragmentácia Debye-Scherrerovho prstenca AgNP-II a AgNP-III je spôsobená skutočnosťou, že ED obraz je zachytený pri rovnakom zväčšení, takže so zvyšovaním veľkosti častíc sa počet difraktovaných častíc na jednotková plocha sa zväčšuje a zmenšuje .
Je známe, že veľkosť a tvar nanočastíc ovplyvňuje biologickú aktivitu.3,45 Katalytickú a biologickú aktivitu závislú od tvaru možno vysvetliť skutočnosťou, že rôzne tvary majú tendenciu proliferovať určité plochy kryštálov (s rôznymi Millerovými indexmi) a tieto plochy kryštálov majú rôzne aktivity.45,46 Pretože pripravené častice poskytujú podobné výsledky ED zodpovedajúce veľmi podobným charakteristikám kryštálov, možno predpokladať, že v našich nasledujúcich experimentoch s koloidnou stabilitou a biologickou aktivitou by sa akékoľvek pozorované rozdiely mali pripísať veľkosti nanočastíc, nie vlastnostiam súvisiacim s tvarom.
Výsledky UV-Vis zhrnuté na obrázku 2D ďalej zdôrazňujú ohromujúcu sférickú povahu syntetizovaného AgNP, pretože vrcholy SPR všetkých troch vzoriek sú okolo 400 nm, čo je charakteristická hodnota sférických nanočastíc striebra.29,30 Zachytené spektrá tiež potvrdili úspešný rast nanostriebra sprostredkovaný semenami.Ako sa veľkosť častíc zvyšuje, vlnová dĺžka zodpovedajúca maximálnej absorpcii svetla AgNP-II - výraznejšie - Podľa literatúry zaznamenal AgNP-III červený posun.6,29
Pokiaľ ide o počiatočnú koloidnú stabilitu systému AgNP, na meranie priemerného hydrodynamického priemeru a zeta potenciálu častíc pri pH 7,2 sa použil DLS.Výsledky zobrazené na obrázku 2E ukazujú, že AgNP-III má vyššiu koloidnú stabilitu ako AgNP-I alebo AgNP-II, pretože spoločné usmernenia naznačujú, že zeta potenciál 30 mV absolútny je nevyhnutný pre dlhodobú koloidnú stabilitu Toto zistenie je ďalej podporené, keď priemerná hodnota Z (získaná ako priemerný hydrodynamický priemer voľných a agregovaných častíc) sa porovnáva s primárnou veľkosťou častíc získanou pomocou TEM, pretože čím bližšie sú tieto dve hodnoty, tým miernejší je stupeň zberu vo vzorke.V skutočnosti je priemer Z AgNP-I a AgNP-II primerane vyšší ako ich hlavná veľkosť častíc vyhodnotená TEM, takže v porovnaní s AgNP-III sa predpokladá, že tieto vzorky budú s väčšou pravdepodobnosťou agregovať, kde je vysoko negatívny zeta potenciál je sprevádzaná blízkou veľkosťou Priemerná hodnota Z.
Vysvetlenie tohto javu môže byť dvojaké.Na jednej strane sa koncentrácia citrátu udržiava na podobnej úrovni vo všetkých krokoch syntézy, čo poskytuje relatívne vysoké množstvo nabitých povrchových skupín, aby sa zabránilo znižovaniu špecifickej plochy povrchu rastúcich častíc.Podľa Levaka a kol. sa však malé molekuly, ako je citrát, dajú ľahko vymeniť za biomolekuly na povrchu nanočastíc.V tomto prípade bude koloidná stabilita určená korónou produkovaných biomolekúl.31 Pretože toto správanie bolo pozorované aj pri našich agregačných meraniach (podrobnejšie diskutované neskôr), samotné citrátové zakončenie nemôže vysvetliť tento jav.
Na druhej strane je veľkosť častíc nepriamo úmerná tendencii agregácie na úrovni nanometrov.Podporuje to najmä tradičná metóda Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO), kde je príťažlivosť častíc opísaná ako súčet príťažlivých a odpudivých síl medzi časticami.Podľa He et al., maximálna hodnota energetickej krivky DLVO klesá s veľkosťou nanočastíc v nanočasticiach hematitu, čím sa uľahčuje dosiahnutie minimálnej primárnej energie, čím sa podporuje ireverzibilná agregácia (kondenzácia).47 Špekuluje sa však, že existujú aj iné aspekty, ktoré presahujú obmedzenia teórie DLVO.Hoci van der Waalsova gravitácia a elektrostatická dvojvrstvová odpudivosť sú podobné so zvyšujúcou sa veľkosťou častíc, prehľad Hotze et al.navrhuje, že má silnejší vplyv na agregáciu, ako umožňuje DLVO.14 Domnievajú sa, že zakrivenie povrchu nanočastíc už nemožno odhadnúť ako plochý povrch, takže matematický odhad nie je použiteľný.Okrem toho, keď sa veľkosť častíc znižuje, percento atómov prítomných na povrchu sa zvyšuje, čo vedie k elektronickej štruktúre a správaniu sa povrchového náboja.A zmeny povrchovej reaktivity, čo môže viesť k zníženiu náboja v elektrickej dvojvrstve a podporiť agregáciu.
Pri porovnaní výsledkov DLS AgNP-I, AgNP-II a AgNP-III na obrázku 3 sme pozorovali, že všetky tri vzorky vykazovali podobnú agregáciu vyvolávajúcu pH.Silne kyslé prostredie (pH 3) posúva zeta potenciál vzorky na 0 mV, čo spôsobuje, že častice vytvárajú agregáty s mikrónovou veľkosťou, zatiaľ čo alkalické pH posúva jeho zeta potenciál na väčšiu zápornú hodnotu, kde častice tvoria menšie agregáty (pH 5 ).A 7,2) ), alebo zostanú úplne neagregované (pH 9).Pozorovali sa aj niektoré dôležité rozdiely medzi rôznymi vzorkami.Počas celého experimentu sa AgNP-I ukázal ako najcitlivejší na zmeny zeta potenciálu vyvolané pH, pretože zeta potenciál týchto častíc bol znížený pri pH 7,2 v porovnaní s pH 9, zatiaľ čo AgNP-II a AgNP-III vykazovali iba A značná zmena v ζ je okolo pH 3. Okrem toho AgNP-II vykazoval pomalšie zmeny a mierny zeta potenciál, zatiaľ čo AgNP-III vykazoval najmiernejšie správanie zo všetkých troch, pretože systém vykazoval najvyššiu absolútnu hodnotu zeta a pomalý pohyb trendu, čo naznačuje AgNP-III Najviac odolný voči agregácii vyvolanej pH.Tieto výsledky sú v súlade s výsledkami merania priemerného hydrodynamického priemeru.Vzhľadom na veľkosť častíc ich primérov, AgNP-I vykazoval konštantnú postupnú agregáciu pri všetkých hodnotách pH, ​​najpravdepodobnejšie v dôsledku 10 mM NaCl pozadia, zatiaľ čo AgNP-II a AgNP-III vykazovali významné hodnoty len pri pH 3 zhromažďovania.Najzaujímavejší rozdiel je v tom, že napriek veľkej veľkosti nanočastíc AgNP-III tvorí najmenšie agregáty pri pH 3 za 24 hodín, čo zvýrazňuje jeho antiagregačné vlastnosti.Vydelením priemerného Z AgNP pri pH 3 po 24 hodinách hodnotou pripravenej vzorky je možné pozorovať, že relatívne veľkosti agregátov AgNP-I a AgNP-II sa zvýšili 50-krát, 42-krát a 22-krát. , resp.III.
Obrázok 3 Výsledky dynamického rozptylu svetla vzorky nanočastíc striebra zakončených citrátom s rastúcou veľkosťou (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II a 50 nm: AgNP-III) sú vyjadrené ako stredný hydrodynamický priemer (Z priemer ) (vpravo) Pri rôznych podmienkach pH sa zeta potenciál (vľavo) mení v priebehu 24 hodín.
Pozorovaná agregácia závislá od pH tiež ovplyvnila charakteristickú povrchovú plazmónovú rezonanciu (SPR) vzoriek AgNP, čo dokazujú ich UV-Vis spektrá.Podľa doplnkového obrázku S1 po agregácii všetkých troch suspenzií nanočastíc striebra nasleduje zníženie intenzity ich SPR vrcholov a mierny červený posun.Rozsah týchto zmien ako funkcia pH je v súlade so stupňom agregácie predpovedaným výsledkami DLS, boli však pozorované niektoré zaujímavé trendy.Na rozdiel od intuície sa ukazuje, že stredne veľký AgNP-II je najcitlivejší na zmeny SPR, zatiaľ čo ostatné dve vzorky sú menej citlivé.Vo výskume SPR je 50 nm teoretická hranica veľkosti častíc, ktorá sa používa na rozlíšenie častíc na základe ich dielektrických vlastností.Častice menšie ako 50 nm (AgNP-I a AgNP-II) možno opísať ako jednoduché dielektrické dipóly, zatiaľ čo častice, ktoré dosiahnu alebo prekročia túto hranicu (AgNP-III), majú zložitejšie dielektrické vlastnosti a ich rezonancia Pás sa rozdeľuje na multimodálne zmeny .V prípade dvoch menších vzoriek častíc možno AgNP považovať za jednoduché dipóly a plazma sa môže ľahko prekrývať.Keď sa veľkosť častíc zvyšuje, toto spojenie v podstate vytvára väčšiu plazmu, čo môže vysvetľovať vyššiu pozorovanú citlivosť.29 Avšak pre najväčšie častice nie je jednoduchý odhad dipólu platný, keď sa môžu vyskytnúť aj iné kopulačné stavy, čo môže vysvetliť zníženú tendenciu AgNP-III indikovať spektrálne zmeny.29
V našich experimentálnych podmienkach je dokázané, že hodnota pH má zásadný vplyv na koloidnú stabilitu nanočastíc striebra potiahnutých citrátom rôznych veľkostí.V týchto systémoch je stabilita zabezpečená záporne nabitými -COO- skupinami na povrchu AgNP.Karboxylátová funkčná skupina citrátového iónu je protónovaná vo veľkom počte H+ iónov, takže vytvorená karboxylová skupina už nemôže poskytovať elektrostatické odpudzovanie medzi časticami, ako je znázornené v hornom rade na obrázku 4. Podľa Le Chatelierovho princípu AgNP vzorky rýchlo agregujú pri pH 3, ale postupne sa stávajú stále stabilnejšími so zvyšujúcim sa pH.
Obrázok 4 Schematický mechanizmus povrchovej interakcie definovaný agregáciou pri rôznych pH (horný riadok), koncentrácii NaCl (stredný riadok) a biomolekulách (dolný riadok).
Podľa obrázku 5 sa koloidná stabilita v suspenziách AgNP rôznych veľkostí skúmala aj pri zvyšujúcich sa koncentráciách soli.Na základe zeta potenciálu zvýšená veľkosť nanočastíc v týchto systémoch AgNP ukončených citrátom opäť poskytuje zvýšenú odolnosť voči vonkajším vplyvom NaCl.V AgNP-I stačí 10 mM NaCl na vyvolanie miernej agregácie a koncentrácia soli 50 mM poskytuje veľmi podobné výsledky.V AgNP-II a AgNP-III 10 mM NaCl významne neovplyvňuje zeta potenciál, pretože ich hodnoty zostávajú na (AgNP-II) alebo pod (AgNP-III) -30 mV.Zvýšenie koncentrácie NaCl na 50 mM a nakoniec na 150 mM NaCl je dostatočné na výrazné zníženie absolútnej hodnoty zeta potenciálu vo všetkých vzorkách, hoci väčšie častice si zachovávajú viac negatívneho náboja.Tieto výsledky sú v súlade s očakávaným priemerným hydrodynamickým priemerom AgNP;Z priemerné trendové čiary merané na 10, 50 a 150 mM NaCl vykazujú rôzne, postupne sa zvyšujúce hodnoty.Nakoniec boli vo všetkých troch 150 mM experimentoch detegované agregáty s mikrónovou veľkosťou.
Obrázok 5 Výsledky dynamického rozptylu svetla vzorky nanočastíc striebra zakončených citrátom s rastúcou veľkosťou (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II a 50 nm: AgNP-III) sú vyjadrené ako priemerný hydrodynamický priemer (Z priemer ) (vpravo) a zeta potenciál (vľavo) sa menia do 24 hodín pri rôznych koncentráciách NaCl.
Výsledky UV-Vis na doplnkovom obrázku S2 ukazujú, že SPR 50 a 150 mM NaCl vo všetkých troch vzorkách má okamžitý a významný pokles.To možno vysvetliť pomocou DLS, pretože agregácia na báze NaCl prebieha rýchlejšie ako experimenty závislé od pH, čo sa vysvetľuje veľkým rozdielom medzi skorými (0, 1, 5 a 3 hodiny) meraniami.Okrem toho zvýšenie koncentrácie soli tiež zvýši relatívnu permitivitu experimentálneho média, čo bude mať hlboký vplyv na povrchovú plazmónovú rezonanciu.29
Účinok NaCl je zhrnutý v strednom riadku obrázku 4. Vo všeobecnosti možno konštatovať, že zvýšenie koncentrácie chloridu sodného má podobný účinok ako zvýšenie kyslosti, pretože ióny Na+ majú tendenciu koordinovať sa okolo karboxylátových skupín, potlačenie negatívneho zeta potenciálu AgNP.Okrem toho 150 mM NaCl vytvorilo agregáty s mikrónovou veľkosťou vo všetkých troch vzorkách, čo naznačuje, že fyziologická koncentrácia elektrolytu je škodlivá pre koloidnú stabilitu AgNP zakončených citrátom.Vzhľadom na kritickú kondenzačnú koncentráciu (CCC) NaCl na podobných systémoch AgNP je možné tieto výsledky šikovne umiestniť do príslušnej literatúry.Huynh a kol.vypočítali, že CCC NaCl pre nanočastice striebra zakončené citrátom s priemerným priemerom 71 nm bol 47,6 mM, zatiaľ čo El Badawy et al.pozorovali, že CCC 10 nm AgNP s citrátovým povlakom bol 70 mM.10,16 Okrem toho He et al. nameral významne vysoký CCC okolo 300 mM, čo spôsobilo, že ich spôsob syntézy sa líšil od vyššie uvedenej publikácie.48 Hoci súčasný príspevok nie je zameraný na komplexnú analýzu týchto hodnôt, pretože naše experimentálne podmienky narastajú v komplexnosti celej štúdie, biologicky relevantná koncentrácia NaCl 50 mM, najmä 150 mM NaCl, sa zdá byť dosť vysoká.Indukovaná koagulácia, vysvetľujúca zistené silné zmeny.
Ďalším krokom v polymerizačnom experimente je použitie jednoduchých, ale biologicky relevantných molekúl na simuláciu interakcií nanočastíc a biomolekúl.Na základe výsledkov DLS (obrázky 6 a 7) a UV-Vis (doplnkové obrázky S3 a S4) možno vyvodiť niektoré všeobecné závery.V našich experimentálnych podmienkach nebudú študované molekuly glukózy a glutamínu indukovať agregáciu v žiadnom AgNP systéme, pretože trend Z-priemeru úzko súvisí s príslušnou referenčnou hodnotou merania.Aj keď ich prítomnosť neovplyvňuje agregáciu, experimentálne výsledky ukazujú, že tieto molekuly sú čiastočne adsorbované na povrchu AgNP.Najvýraznejším výsledkom, ktorý podporuje tento názor, je pozorovaná zmena absorpcie svetla.Aj keď AgNP-I nevykazuje zmysluplné zmeny vlnovej dĺžky alebo intenzity, možno ho pozorovať jasnejšie meraním väčších častíc, čo je pravdepodobne spôsobené vyššou optickou citlivosťou uvedenou vyššie.Bez ohľadu na koncentráciu môže glukóza spôsobiť väčší červený posun po 1,5 hodine v porovnaní s kontrolným meraním, čo je asi 40 nm v AgNP-II a asi 10 nm v AgNP-III, čo dokazuje výskyt povrchových interakcií .Glutamín vykazoval podobný trend, ale zmena nebola taká zjavná.Okrem toho je tiež potrebné spomenúť, že glutamín môže znížiť absolútny zeta potenciál stredných a veľkých častíc.Keďže sa však zdá, že tieto zmeny zeta neovplyvňujú úroveň agregácie, možno špekulovať, že aj malé biomolekuly, ako je glutamín, môžu poskytnúť určitý stupeň priestorového odpudzovania medzi časticami.
Obrázok 6 Výsledky dynamického rozptylu svetla vzoriek nanočastíc striebra zakončených citrátom s rastúcou veľkosťou (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II a 50 nm: AgNP-III) sú vyjadrené ako stredný hydrodynamický priemer (Z priemer) (vpravo) Pri vonkajších podmienkach rôznych koncentrácií glukózy sa zeta potenciál (vľavo) mení do 24 hodín.
Obrázok 7 Výsledky dynamického rozptylu svetla vzorky nanočastíc striebra zakončených citrátom s rastúcou veľkosťou (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II a 50 nm: AgNP-III) sú vyjadrené ako stredný hydrodynamický priemer (Z priemer ) (vpravo) V prítomnosti glutamínu sa zeta potenciál (vľavo) mení do 24 hodín.
Stručne povedané, malé biomolekuly ako glukóza a glutamín neovplyvňujú koloidnú stabilitu pri meranej koncentrácii: hoci ovplyvňujú zeta potenciál a výsledky UV-Vis v rôznej miere, výsledky Z priemeru nie sú konzistentné.To naznačuje, že povrchová adsorpcia molekúl inhibuje elektrostatické odpudzovanie, ale zároveň poskytuje rozmerovú stabilitu.
Aby sme prepojili predchádzajúce výsledky s predchádzajúcimi výsledkami a zručnejšie simulovali biologické podmienky, vybrali sme niektoré z najbežnejšie používaných komponentov bunkovej kultúry a použili sme ich ako experimentálne podmienky na štúdium stability AgNP koloidov.V celom experimente in vitro je jednou z najdôležitejších funkcií DMEM ako média vytvorenie potrebných osmotických podmienok, no z chemického hľadiska ide o komplexný soľný roztok s celkovou iónovou silou podobnou 150 mM NaCl. .40 Pokiaľ ide o FBS, ide o komplexnú zmes biomolekúl – najmä bielkovín – z hľadiska povrchovej adsorpcie má určité podobnosti s experimentálnymi výsledkami glukózy a glutamínu, napriek chemickému zloženiu a rozmanitosti Pohlavie je oveľa komplikovanejšie.19 DLS a UV-Viditeľné výsledky zobrazené na obrázku 8 a doplnkovom obrázku S5 možno vysvetliť preskúmaním chemického zloženia týchto materiálov a ich koreláciou s meraniami v predchádzajúcej časti.
Obrázok 8 Výsledky dynamického rozptylu svetla vzorky nanočastíc striebra zakončených citrátom s rastúcou veľkosťou (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II a 50 nm: AgNP-III) sú vyjadrené ako priemerný hydrodynamický priemer (Z priemer ) (vpravo) V prítomnosti zložiek bunkovej kultúry DMEM a FBS sa zeta potenciál (vľavo) mení v priebehu 24 hodín.
Riedenie AgNP rôznych veľkostí v DMEM má podobný účinok na koloidnú stabilitu ako ten, ktorý sa pozoruje v prítomnosti vysokých koncentrácií NaCl.Disperzia AgNP v 50 v/v % DMEM ukázala, že bola detegovaná agregácia vo veľkom meradle so zvýšením zeta potenciálu a Z-priemernej hodnoty a prudkým poklesom intenzity SPR.Stojí za zmienku, že maximálna veľkosť agregátu indukovaná DMEM po 24 hodinách je nepriamo úmerná veľkosti nanočastíc priméru.
Interakcia medzi FBS a AgNP je podobná interakcii pozorovanej v prítomnosti menších molekúl, ako je glukóza a glutamín, ale účinok je silnejší.Priemer Z častíc zostáva nedotknutý, pričom sa zistí zvýšenie zeta potenciálu.Vrchol SPR vykazoval mierny červený posun, no možno ešte zaujímavejšie je, že intenzita SPR neklesla tak výrazne ako pri kontrolnom meraní.Tieto výsledky možno vysvetliť vrodenou adsorpciou makromolekúl na povrchu nanočastíc (spodný riadok na obrázku 4), ktorá sa dnes chápe ako tvorba biomolekulovej koróny v tele.49