Nanodelci srebra (AgNP) veljajo za potencialno uporabno orodje za nadzor različnih patogenov.Vendar pa obstajajo pomisleki glede sproščanja AgNP v okoljske medije, saj lahko povzročijo škodljive učinke na zdravje ljudi in okolje.V tej študiji smo razvili in ovrednotili nov mikrometrski magnetni hibridni koloid (MHC), okrašen z različno velikimi AgNP (AgNP-MHC).Po uporabi za dezinfekcijo je mogoče te delce zlahka pridobiti iz okoljskih medijev z uporabo njihovih magnetnih lastnosti in ostanejo učinkoviti pri inaktivaciji virusnih patogenov.Ocenili smo učinkovitost AgNP-MHC za inaktivacijo bakteriofaga ϕX174, mišjega norovirusa (MNV) in adenovirusa serotipa 2 (AdV2).Ti ciljni virusi so bili izpostavljeni AgNP-MHCs za 1, 3 in 6 ur pri 25 °C in nato analizirani s testom plakov in TaqMan PCR v realnem času.AgNP-MHC so bili izpostavljeni širokemu razponu pH vrednosti ter vodovodni in površinski vodi, da bi ocenili njihove protivirusne učinke v različnih okoljskih pogojih.Med tremi vrstami testiranih AgNP-MHC so Ag30-MHC pokazali največjo učinkovitost pri inaktivaciji virusov.ϕX174 in MNV sta se zmanjšala za več kot 2 log10 po izpostavitvi 4,6 × 109 Ag30-MHCs/ml za 1 uro.Ti rezultati so pokazali, da bi lahko AgNP-MHC uporabili za inaktivacijo virusnih patogenov z minimalno možnostjo morebitnega sproščanja v okolje.

Z nedavnim napredkom nanotehnologije so nanodelci deležni vse večje pozornosti po vsem svetu na področjih biotehnologije, medicine in javnega zdravja (1,2).Zaradi visokega razmerja med površino in volumnom imajo materiali nano velikosti, običajno v razponu od 10 do 500 nm, edinstvene fizikalno-kemijske lastnosti v primerjavi z večjimi materiali (1).Obliko in velikost nanomaterialov je mogoče nadzorovati, specifične funkcionalne skupine pa lahko konjugiramo na njihovih površinah, da omogočimo interakcije z določenimi proteini ali intracelularni privzem (3,–5).

Nanodelci srebra (AgNP) so bili obsežno raziskani kot protimikrobno sredstvo (6).Srebro se uporablja pri izdelavi finega jedilnega pribora, za okrasje in v terapevtskih sredstvih.Srebrove spojine, kot je srebrov sulfadiazin in nekatere soli, so bile zaradi svojih protimikrobnih lastnosti uporabljene kot izdelki za nego ran in za zdravljenje nalezljivih bolezni (6,7).Nedavne študije so pokazale, da so AgNP zelo učinkoviti za inaktivacijo različnih vrst bakterij in virusov (8,–11).AgNP in Ag+ ioni, ki se sproščajo iz AgNP, neposredno komunicirajo z biomolekulami, ki vsebujejo fosfor ali žveplo, vključno z DNA, RNA in proteini (12,–14).Pokazalo se je tudi, da ustvarjajo reaktivne kisikove spojine (ROS), ki povzročajo poškodbe membrane v mikroorganizmih (15).Velikost, oblika in koncentracija AgNP so prav tako pomembni dejavniki, ki vplivajo na njihove protimikrobne sposobnosti (8,10,13,16,17).

Prejšnje študije so poudarile tudi več težav, ko se AgNP uporabljajo za nadzor patogenov v vodnem okolju.Prvič, obstoječe študije o učinkovitosti AgNP za inaktivacijo virusnih patogenov v vodi so omejene.Poleg tega so monodisperzni AgNP zaradi svoje majhnosti in velike površine običajno podvrženi agregaciji med delci, ti agregati pa zmanjšujejo učinkovitost AgNP proti mikrobnim patogenom (7).Končno se je pokazalo, da imajo AgNP različne citotoksične učinke (5,18,–20), sproščanje AgNP v vodno okolje pa bi lahko povzročilo zdravstvene in ekološke težave ljudi.

Pred kratkim smo razvili nov mikrometrski magnetni hibridni koloid (MHC), okrašen z AgNP različnih velikosti (21,22).Jedro MHC se lahko uporablja za pridobivanje kompozitov AgNP iz okolja.Ocenili smo protivirusno učinkovitost teh srebrovih nanodelcev na MHC (AgNP-MHC) z uporabo bakteriofaga ϕX174, mišjega norovirusa (MNV) in adenovirusa v različnih okoljskih pogojih.

Protivirusni učinki AgNP-MHC v različnih koncentracijah proti bakteriofagu ϕX174 (a), MNV (b) in AdV2 (c).Ciljne viruse smo obdelali z različnimi koncentracijami AgNP-MHCs in z OH-MHCs (4,6 × 109 delcev/ml) kot kontrolo v stresalnem inkubatorju (150 rpm, 1 h, 25 °C).Za merjenje preživelih virusov je bila uporabljena metoda testiranja plakov.Vrednosti so povprečja ± standardna odstopanja (SD) iz treh neodvisnih poskusov.Zvezdice označujejo bistveno drugačne vrednosti (P< 0,05 z enosmerno ANOVA z Dunnettovim testom).

Ta študija je pokazala, da so AgNP-MHC učinkoviti za inaktivacijo bakteriofagov in MNV, nadomestka za človeški norovirus, v vodi.Poleg tega je mogoče AgNP-MHC enostavno obnoviti z magnetom, kar učinkovito preprečuje sproščanje potencialno strupenih AgNP v okolje.Številne predhodne študije so pokazale, da sta koncentracija in velikost delcev AgNP kritična dejavnika za inaktivacijo ciljnega mikroorganizma (8,16,17).Protimikrobni učinki AgNP so odvisni tudi od vrste mikroorganizma.Učinkovitost AgNP-MHC za inaktivacijo ϕX174 je sledila razmerju med odmerkom in odzivom.Med testiranimi AgNP-MHC so imeli Ag30-MHC večjo učinkovitost pri inaktivaciji ϕX174 in MNV.Za MNV so samo Ag30-MHC pokazali protivirusno aktivnost, pri čemer drugi AgNP-MHC niso povzročili pomembne inaktivacije MNV.Nobeden od AgNP-MHC ni imel pomembnega protivirusnega delovanja proti AdV2.

Poleg velikosti delcev je bila pomembna tudi koncentracija srebra v AgNP-MHC.Zdi se, da koncentracija srebra določa učinkovitost protivirusnih učinkov AgNP-MHC.Koncentracije srebra v raztopinah Ag07-MHCs in Ag30-MHCs pri 4,6 × 109 delcev/ml so bile 28,75 ppm oziroma 200 ppm in korelirale s stopnjo protivirusne aktivnosti.Tabela 2povzema koncentracije srebra in površine testiranih AgNP-MHC.Ag07-MHC so pokazali najnižjo protivirusno aktivnost in imeli najnižjo koncentracijo srebra in površino, kar kaže, da so te lastnosti povezane s protivirusno aktivnostjo AgNP-MHC.

Naša prejšnja študija je pokazala, da so glavni protimikrobni mehanizmi AgNP-MHC kemična abstrakcija Mg2+ ali Ca2+ ionov iz mikrobnih membran, ustvarjanje kompleksov s tiolnimi skupinami, ki se nahajajo na membranah, in generiranje reaktivnih kisikovih vrst (ROS) (21).Ker imajo AgNP-MHC relativno veliko velikost delcev (∼500 nm), je malo verjetno, da lahko prodrejo skozi virusno kapsido.Namesto tega se zdi, da AgNP-MHC interagirajo z virusnimi površinskimi proteini.AgNP na kompozitih se nagibajo k vezavi biomolekul, ki vsebujejo tiolno skupino in so vgrajene v beljakovine plašča virusov.Zato so biokemične lastnosti virusnih kapsidnih proteinov pomembne za določanje njihove občutljivosti na AgNP-MHC.Slika 1prikazuje različno občutljivost virusov na učinke AgNP-MHC.Bakteriofaga ϕX174 in MNV sta bila dovzetna za AgNP-MHC, vendar je bil AdV2 odporen.Visoka raven odpornosti AdV2 je verjetno povezana z njegovo velikostjo in strukturo.Adenovirusi so veliki od 70 do 100 nm (30), zaradi česar so veliko večji od ϕX174 (27 do 33 nm) in MNV (28 do 35 nm) (31,32).Poleg velike velikosti imajo adenovirusi za razliko od drugih virusov dvoverižno DNK in so odporni na različne okoljske obremenitve, kot sta vročina in UV sevanje (33,34).Naša prejšnja študija je poročala, da je prišlo do zmanjšanja MS2 za skoraj 3-log10 z Ag30-MHC v 6 urah (21).MS2 in ϕX174 imata podobne velikosti z različnimi vrstami nukleinske kisline (RNA ali DNA), vendar imata podobne stopnje inaktivacije z Ag30-MHC.Zato se zdi, da narava nukleinske kisline ni glavni dejavnik za odpornost proti AgNP-MHC.Namesto tega se zdi, da sta velikost in oblika virusnega delca pomembnejši, ker je adenovirus veliko večji virus.Ag30-MHC so dosegli skoraj 2-log10 zmanjšanje M13 v 6 urah (naši neobjavljeni podatki).M13 je enoverižni DNA virus (35) in je ~880 nm v dolžino in 6,6 nm v premeru (36).Stopnja inaktivacije nitastega bakteriofaga M13 je bila vmesna med stopnjami majhnih virusov z okroglo strukturo (MNV, ϕX174 in MS2) in velikim virusom (AdV2).

V tej študiji se je inaktivacijska kinetika MNV pomembno razlikovala pri testu plaka in testu RT-PCR (Slika 2bininc).c).Znano je, da molekularni testi, kot je RT-PCR, znatno podcenjujejo stopnje inaktivacije virusov (25,28), kot smo ugotovili v naši študiji.Ker AgNP-MHC medsebojno delujejo predvsem s površino virusa, obstaja večja verjetnost, da bodo poškodovali beljakovine virusne ovojnice kot virusne nukleinske kisline.Zato lahko test RT-PCR za merjenje virusne nukleinske kisline znatno podceni inaktivacijo virusov.Učinek ionov Ag+ in nastajanje reaktivnih kisikovih spojin (ROS) naj bi bila odgovorna za inaktivacijo testiranih virusov.Vendar pa so številni vidiki protivirusnih mehanizmov AgNP-MHC še vedno nejasni in potrebne so nadaljnje raziskave z uporabo biotehnoloških pristopov, da se pojasni mehanizem visoke odpornosti AdV2.

Na koncu smo ovrednotili robustnost protivirusne aktivnosti Ag30-MHC tako, da smo jih izpostavili širokemu razponu pH vrednosti in vzorcem vode iz pipe in površinske vode, preden smo izmerili njihovo protivirusno aktivnost (Slika 3inin4).4).Izpostavljenost pogojem z izjemno nizkim pH je povzročila fizično in/ali funkcionalno izgubo AgNP iz MHC (neobjavljeni podatki).V prisotnosti nespecifičnih delcev so Ag30-MHC dosledno kazali protivirusno aktivnost, kljub zmanjšanju protivirusne aktivnosti proti MS2.Protivirusna aktivnost je bila najnižja v nefiltrirani površinski vodi, saj je interakcija med Ag30-MHC in nespecifičnimi delci v zelo motni površinski vodi verjetno povzročila zmanjšanje protivirusne aktivnosti (Tabela 3).Zato je treba v prihodnosti izvesti terenske ocene AgNP-MHC v različnih vrstah vode (npr. z različnimi koncentracijami soli ali huminske kisline).

Skratka, novi kompoziti Ag, AgNP-MHC, imajo odlične protivirusne zmogljivosti proti več virusom, vključno z ϕX174 in MNV.AgNP-MHC ohranjajo močno učinkovitost v različnih okoljskih pogojih, te delce pa je mogoče zlahka obnoviti z uporabo magneta, s čimer se zmanjšajo njihovi morebitni škodljivi učinki na zdravje ljudi in okolje.Ta študija je pokazala, da je kompozit AgNP lahko učinkovito protivirusno sredstvo v različnih okoljskih okoljih, brez večjih ekoloških tveganj.