Javascript är för närvarande inaktiverat i din webbläsare.När javascript är inaktiverat kommer vissa funktioner på denna webbplats inte att fungera.
Registrera dina specifika uppgifter och specifika läkemedel av intresse, så matchar vi informationen du tillhandahåller med artiklar i vår omfattande databas och skickar dig en PDF-kopia via e-post i god tid.
Är mindre nanopartiklar alltid bättre?Förstå de biologiska effekterna av storleksberoende aggregering av silvernanopartiklar under biologiskt relevanta förhållanden
Författare: Bélteky P, Rónavári A, Zakupszky D, Boka E, Igaz N, Szerencsés B, Pfeiffer I, Vágvölgyi C, Kiricsi M, Kónya Z
Péter Bélteky,1,* Andrea Rónavári,1,* Dalma Zakupszky,1 Eszter Boka,1 Nóra Igaz,2 Bettina Szerencsés,3 Ilona Pfeiffer,3 Csaba Vágvölgyi,3 Mónika Kiricsi från Environmental Chemistry, Ungern, vetenskaps- och informatikfakulteten i Ungern , universitetet i Szeged;2 Institutionen för biokemi och molekylärbiologi, fakulteten för naturvetenskap och information, universitetet i Szeged, Ungern;3 Institutionen för mikrobiologi, fakulteten för naturvetenskap och information, universitetet i Szeged, Ungern;4MTA-SZTE Reaction Kinetics and Surface Chemistry Research Group, Szeged, Ungern* Dessa författare bidrog lika mycket till detta arbete.Kommunikation: Zoltán Kónya Institutionen för tillämpad kemi och miljökemi, fakulteten för naturvetenskap och informatik, University of Szeged, Rerrich Square 1, Szeged, H-6720, Ungern Telefon +36 62 544620 E-post [E-postskydd] Syfte: Silvernanopartiklar (AgNP) är ett av de mest studerade nanomaterialen, särskilt på grund av deras biomedicinska tillämpningar.Men på grund av aggregationen av nanopartiklar, äventyras deras utmärkta cytotoxicitet och antibakteriella aktivitet ofta i biologiska medier.I detta arbete studerades aggregationsbeteendet och relaterade biologiska aktiviteter hos tre olika citratterminerade silvernanopartikelprover med en genomsnittlig diameter på 10, 20 och 50 nm.Metod: Använd transmissionselektronmikroskop för att syntetisera och karakterisera nanopartiklar, utvärdera deras aggregationsbeteende vid olika pH-värden, NaCl, glukos och glutaminkoncentrationer genom dynamisk ljusspridning och ultraviolett-synlig spektroskopi.Dessutom förbättrar komponenter som Dulbecco i cellodlingsmediet aggregationsbeteendet i Eagle Medium och Fetal Calf Serum.Resultat: Resultaten visar att surt pH och fysiologiskt elektrolytinnehåll i allmänhet inducerar aggregering i mikronskala, vilket kan förmedlas genom bildandet av biomolekylär korona.Det är värt att notera att större partiklar uppvisar högre motståndskraft mot yttre påverkan än sina mindre motsvarigheter.In vitro cytotoxicitet och antibakteriella tester utfördes genom att behandla celler med nanopartikelaggregat i olika aggregationsstadier.Slutsats: Våra resultat avslöjar en djupgående korrelation mellan kolloidal stabilitet och toxiciteten hos AgNP, eftersom extrem aggregering leder till fullständig förlust av biologisk aktivitet.Den högre graden av anti-aggregation som observeras för större partiklar har en betydande inverkan på in vitro-toxicitet, eftersom sådana prover behåller mer antimikrobiell och däggdjurscellaktivitet.Dessa fynd leder till slutsatsen att, trots den allmänna uppfattningen i den relevanta litteraturen, inriktning på minsta möjliga nanopartiklar kanske inte är det bästa tillvägagångssättet.Nyckelord: frömedierad tillväxt, kolloidal stabilitet, storleksberoende aggregationsbeteende, aggregationsskadatoxicitet
När efterfrågan och produktionen av nanomaterial fortsätter att öka, ägnas mer och mer uppmärksamhet åt deras biosäkerhet eller biologiska aktivitet.Silvernanopartiklar (AgNP) är en av de mest syntetiserade, undersökta och använda representanterna för denna klass av material på grund av deras utmärkta katalytiska, optiska och biologiska egenskaper.1 Det anses allmänt att de unika egenskaperna hos nanomaterial (inklusive AgNP) främst tillskrivs deras stora specifika yta.Därför är det oundvikligen problemet varje process som påverkar denna nyckelfunktion, såsom partikelstorlek, ytbeläggning eller aggregering, om det kommer att allvarligt skada egenskaperna hos nanopartiklar som är kritiska för specifika tillämpningar.
Effekterna av partikelstorlek och stabilisatorer är ämnen som har varit relativt väl dokumenterade i litteraturen.Till exempel är den allmänt accepterade uppfattningen att mindre nanopartiklar är mer giftiga än större nanopartiklar.2 I enlighet med allmän litteratur har våra tidigare studier visat den storleksberoende aktiviteten av nanosilver på däggdjursceller och mikroorganismer.3– 5 Ytbeläggning är en annan egenskap som har ett brett inflytande på egenskaperna hos nanomaterial.Bara genom att lägga till eller modifiera stabilisatorer på dess yta kan samma nanomaterial ha helt olika fysikaliska, kemiska och biologiska egenskaper.Appliceringen av täckmedel utförs oftast som en del av nanopartikelsyntes.Till exempel är citratterminerade silvernanopartiklar en av de mest relevanta AgNP:erna i forskningen, som syntetiseras genom att reducera silversalter i en utvald stabilisatorlösning som reaktionsmedium.6 Citrate kan enkelt dra fördel av dess låga kostnad, tillgänglighet, biokompatibilitet och starka affinitet för silver, vilket kan återspeglas i olika föreslagna interaktioner, från reversibel ytadsorption till joninteraktioner.Små molekyler och polyatomära joner nära 7,8, såsom citrater, polymerer, polyelektrolyter och biologiska medel används också ofta för att stabilisera nano-silver och utföra unika funktionaliseringar på det.9-12
Även om möjligheten att ändra aktiviteten hos nanopartiklar genom avsiktlig ytbeläggning är ett mycket intressant område, är huvudrollen för denna ytbeläggning försumbar, vilket ger kolloidal stabilitet för nanopartikelsystemet.Den stora specifika ytan av nanomaterial kommer att producera stor ytenergi, vilket hindrar systemets termodynamiska förmåga att nå sin minimala energi.13 Utan ordentlig stabilisering kan detta leda till agglomerering av nanomaterial.Aggregering är bildandet av aggregat av partiklar av olika former och storlekar som sker när dispergerade partiklar möts och nuvarande termodynamiska interaktioner gör att partiklarna kan fästa vid varandra.Därför används stabilisatorer för att förhindra aggregation genom att införa en tillräckligt stor repulsiv kraft mellan partiklarna för att motverka deras termodynamiska attraktion.14
Även om ämnet partikelstorlek och yttäckning har undersökts grundligt i samband med dess reglering av biologiska aktiviteter som utlöses av nanopartiklar, är partikelaggregation ett till stor del försummat område.Det finns nästan ingen grundlig studie för att lösa den kolloidala stabiliteten hos nanopartiklar under biologiskt relevanta förhållanden.10,15-17 Dessutom är detta bidrag särskilt sällsynt, där toxiciteten förknippad med aggregering också har studerats, även om det kan orsaka biverkningar, såsom vaskulär trombos, eller förlust av önskade egenskaper, såsom dess toxicitet, som visas i figur 1.18, 19 visas.Faktum är att en av de få kända mekanismerna för silvernanopartikelresistens är relaterad till aggregation, eftersom vissa E. coli- och Pseudomonas aeruginosa-stammar rapporteras minska sin nano-silverkänslighet genom att uttrycka proteinet flagellin, flagellin.Det har en hög affinitet för silver, vilket inducerar aggregation.20
Det finns flera olika mekanismer relaterade till toxiciteten hos silvernanopartiklar, och aggregering påverkar alla dessa mekanismer.Den mest diskuterade metoden för AgNP biologisk aktivitet, ibland kallad "trojansk häst"-mekanism, betraktar AgNP som Ag+-bärare.1,21 Den trojanska hästmekanismen kan säkerställa en stor ökning av den lokala Ag+-koncentrationen, vilket leder till generering av ROS och membrandepolarisering.22-24 Aggregation kan påverka frisättningen av Ag+ och därigenom påverka toxiciteten, eftersom den minskar den effektiva aktiva ytan där silverjoner kan oxideras och lösas upp.Emellertid kommer AgNP inte bara att uppvisa toxicitet genom jonfrisättning.Många storleks- och morfologirelaterade interaktioner måste beaktas.Bland dem är storleken och formen på nanopartikelytan de definierande egenskaperna.4,25 Samlingen av dessa mekanismer kan kategoriseras som "inducerade toxicitetsmekanismer."Det finns potentiellt många mitokondriella och ytmembranreaktioner som kan skada organeller och orsaka celldöd.25-27 Eftersom bildningen av aggregat naturligt påverkar storleken och formen på silverinnehållande föremål som känns igen av levande system, kan dessa interaktioner också påverkas.
I vårt tidigare dokument om aggregation av silvernanopartiklar visade vi ett effektivt screeningförfarande bestående av kemiska och biologiska experiment in vitro för att studera detta problem.19 Dynamisk ljusspridning (DLS) är den föredragna tekniken för dessa typer av inspektioner eftersom materialet kan sprida fotoner med en våglängd som är jämförbar med storleken på dess partiklar.Eftersom den Brownska rörelsehastigheten för partiklar i det flytande mediet är relaterad till storleken, kan förändringen i intensiteten av spritt ljus användas för att bestämma den genomsnittliga hydrodynamiska diametern (Z-medelvärde) för vätskeprovet.28 Dessutom, genom att applicera en spänning på provet, kan zetapotentialen (ζ potential) för nanopartikeln mätas på samma sätt som Z-medelvärdet.13,28 Om det absoluta värdet av zetapotentialen är tillräckligt högt (enligt allmänna riktlinjer > ±30 mV), kommer den att generera stark elektrostatisk repulsion mellan partiklarna för att motverka aggregationen.Karakteristisk ytplasmonresonans (SPR) är ett unikt optiskt fenomen, främst tillskrivet ädelmetallnanopartiklar (främst Au och Ag).29​​ Baserat på de elektroniska svängningarna (ytplasmoner) av dessa material på nanoskala, är det känt att sfäriska AgNP har en karakteristisk UV-Vis-absorptionstopp nära 400 nm.30 Intensiteten och våglängdsförskjutningen av partiklarna används för att komplettera DLS-resultaten, eftersom denna metod kan användas för att detektera nanopartikelaggregation och ytadsorption av biomolekyler.
Baserat på den erhållna informationen utförs cellviabilitet (MTT) och antibakteriella analyser på ett sätt där AgNP-toxicitet beskrivs som en funktion av aggregationsnivå, snarare än (den vanligaste faktorn) nanopartikelkoncentrationen.Denna unika metod tillåter oss att visa den djupa betydelsen av aggregeringsnivån i biologisk aktivitet, eftersom till exempel citratterminerade AgNP helt förlorar sin biologiska aktivitet inom några timmar på grund av aggregering.19
I det pågående arbetet siktar vi på att kraftigt utöka våra tidigare bidrag i stabiliteten av biorelaterade kolloider och deras inverkan på biologisk aktivitet genom att studera effekten av nanopartikelstorlek på nanopartikelaggregation.Detta är utan tvekan en av studierna av nanopartiklar.Ett högre profilperspektiv och 31 För att undersöka denna fråga användes en frömedierad tillväxtmetod för att producera citratterminerade AgNPs i tre olika storleksintervall (10, 20 och 50 nm).6,32 som en av de vanligaste metoderna.För nanomaterial som används allmänt och rutinmässigt i medicinska tillämpningar, väljs citratterminerade AgNP:er av olika storlekar för att studera det möjliga storleksberoendet av de aggregeringsrelaterade biologiska egenskaperna hos nanosilver.Efter att ha syntetiserat AgNP av olika storlekar karakteriserade vi de producerade proverna med transmissionselektronmikroskopi (TEM), och undersökte sedan partiklarna med ovannämnda screeningsprocedur.Dessutom, i närvaro av in vitro cellkulturer Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) och Fetal Bovine Serum (FBS), utvärderades det storleksberoende aggregationsbeteendet och dess beteende vid olika pH-värden, NaCl, glukos och glutaminkoncentrationer.Karakteristika för cytotoxicitet bestäms under omfattande förhållanden.Den vetenskapliga konsensus indikerar att i allmänhet är mindre partiklar att föredra;vår undersökning ger en kemisk och biologisk plattform för att avgöra om så är fallet.
Tre silvernanopartiklar med olika storleksintervall framställdes med den frömedierade tillväxtmetoden som föreslagits av Wan et al., med små justeringar.6 Denna metod är baserad på kemisk reduktion, med silvernitrat (AgNO3) som silverkälla, natriumborhydrid (NaBH4) som reduktionsmedel och natriumcitrat som stabilisator.Förbered först 75 mL 9 mM citratvattenlösning från natriumcitratdihydrat (Na3C6H5O7 x 2H2O) och värm till 70°C.Sedan sattes 2 ml 1% vikt/volym AgNO3-lösning till reaktionsmediet, och sedan hälldes den nyberedda natriumborhydridlösningen (2 ml 0,1% vikt/volym) droppvis i blandningen.Den resulterande gulbruna suspensionen hölls vid 70°C under kraftig omrörning i 1 timme och kyldes sedan till rumstemperatur.Det resulterande provet (hädanefter kallat AgNP-I) används som bas för frömedierad tillväxt i nästa syntessteg.
För att syntetisera en medelstor partikelsuspension (betecknad som AgNP-II), värm 90 mL 7,6 mM citratlösning till 80°C, blanda den med 10 mL AgNP-I och blanda sedan 2 mL 1% w/v AgNO3-lösningen hölls under kraftig mekanisk omrörning i 1 timme och sedan kyldes provet till rumstemperatur.
För den största partikeln (AgNP-III), upprepa samma tillväxtprocess, men i detta fall, använd 10 mL AgNP-II som frösuspension.Efter att proverna uppnått rumstemperatur ställer de in sin nominella Ag-koncentration baserat på det totala AgNO3-innehållet till 150 ppm genom att tillsätta eller avdunsta ytterligare lösningsmedel vid 40°C, och slutligen förvara dem vid 4°C tills vidare användning.
Använd FEI Tecnai G2 20 X-Twin Transmission Electron Microscope (TEM) (FEI Corporate Headquarters, Hillsboro, Oregon, USA) med 200 kV accelerationsspänning för att undersöka de morfologiska egenskaperna hos nanopartiklar och fånga deras elektrondiffraktionsmönster (ED).Minst 15 representativa bilder (~750 partiklar) utvärderades med hjälp av programvaran ImageJ, och de resulterande histogrammen (och alla grafer i hela studien) skapades i OriginPro 2018 (OriginLab, Northampton, MA, USA) 33, 34.
Den genomsnittliga hydrodynamiska diametern (Z-medelvärde), zetapotential (ζ-potential) och karakteristisk ytplasmonresonans (SPR) för proverna mättes för att illustrera deras initiala kolloidala egenskaper.Den genomsnittliga hydrodynamiska diametern och zetapotentialen för provet mättes med Malvern Zetasizer Nano ZS-instrumentet (Malvern Instruments, Malvern, Storbritannien) med användning av engångsvikta kapillärceller vid 37±0,1°C.Ocean Optics 355 DH-2000-BAL UV-Vis-spektrofotometer (Halma PLC, Largo, FL, USA) användes för att erhålla karakteristiska SPR-egenskaper från UV-Vis-absorptionsspektra för prover i intervallet 250-800 nm.
Under hela experimentet genomfördes tre olika mättyper relaterade till kolloidal stabilitet samtidigt.Använd DLS för att mäta den genomsnittliga hydrodynamiska diametern (Z-medelvärde) och zetapotential (ζ-potential) för partiklarna, eftersom Z-medelvärdet är relaterat till medelstorleken på nanopartikelaggregaten, och zetapotentialen indikerar om den elektrostatiska repulsionen i systemet är tillräckligt stark för att kompensera Van der Waals attraktion mellan nanopartiklar.Mätningar görs i tre exemplar, och standardavvikelsen för Z-medelvärde och zetapotential beräknas av Zetasizer-mjukvaran.De karakteristiska SPR-spektra för partiklarna utvärderas med UV-Vis-spektroskopi, eftersom förändringar i toppintensitet och våglängd kan indikera aggregation och ytinteraktioner.29,35 Faktum är att ytplasmonresonans i ädelmetaller är så inflytelserik att den har lett till nya metoder för analys av biomolekyler.29,36,37 Koncentrationen av AgNP i den experimentella blandningen är cirka 10 ppm, och syftet är att ställa in intensiteten för den maximala initiala SPR-absorptionen till 1. Experimentet utfördes på ett tidsberoende sätt vid 0;1,5;3;6;12 och 24 timmar under olika biologiskt relevanta förhållanden.Mer detaljer som beskriver experimentet kan ses i vårt tidigare arbete.19 Kort sagt olika pH-värden (3; 5; 7,2 och 9), olika natriumklorid (10 mM; 50 mM; 150 mM), glukos (3,9 mM; 6,7 mM) och glutamin (4 mM) koncentrationer, och framställde också Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) och fetalt bovint serum (FBS) (i vatten och DMEM) som modellsystem, och studerade deras effekter på aggregationsbeteendet hos de syntetiserade silvernanopartiklarna.pH Värdena på NaCl, glukos och glutamin utvärderas baserat på fysiologiska koncentrationer, medan mängderna DMEM och FBS är desamma som nivåerna som användes i hela in vitro-experimentet.38-42 Alla mätningar utfördes vid pH 7,2 och 37°C med en konstant bakgrundssaltkoncentration på 10 mM NaCl för att eliminera eventuella långväga partikelinteraktioner (förutom vissa pH- och NaCl-relaterade experiment, där dessa attribut är variablerna under studie).28 Listan över olika tillstånd är sammanfattad i tabell 1. Experimentet markerat med † används som referens och motsvarar ett prov innehållande 10 mM NaCl och pH 7,2.
Human prostatacancercellinje (DU145) och immortaliserade humana keratinocyter (HaCaT) erhölls från ATCC (Manassas, VA, USA).Celler odlas rutinmässigt i Dulbeccos minimala essentiella medium Eagle (DMEM) innehållande 4,5 g/L glukos (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), kompletterat med 10 % FBS, 2 mM L-glutamin, 0,01 % streptomycin och 0,005 % Penicillin (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA).Cellerna odlas i en 37°C inkubator under 5 % CO2 och 95 % fuktighet.
För att undersöka förändringarna i AgNP-cytotoxicitet orsakad av partikelaggregation på ett tidsberoende sätt, utfördes en tvåstegs MTT-analys.Först mättes livsdugligheten för de två celltyperna efter behandling med AgNP-I, AgNP-II och AgNP-III.För detta ändamål såddes de två typerna av celler i 96-brunnars plattor med en densitet av 10 000 celler/brunn och behandlades med tre olika storlekar av silvernanopartiklar i ökande koncentrationer den andra dagen.Efter 24 timmars behandling tvättades cellerna med PBS och inkuberades med 0,5 mg/ml MTT-reagens (SERVA, Heidelberg, Tyskland) utspätt i odlingsmedium under 1 timme vid 37°C.Formazankristaller löstes i DMSO (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), och absorptionen mättes vid 570 nm med användning av en Synergy HTX-plattläsare (BioTek-Hungary, Budapest, Ungern).Absorptionsvärdet för det obehandlade kontrollprovet anses vara 100 % överlevnadsgrad.Utför minst 3 experiment med fyra oberoende biologiska replikat.IC50 beräknas från en dosresponskurva baserad på vitalitetsresultat.
Därefter, i det andra steget, genom att inkubera partiklarna med 150 mM NaCl under olika tidsperioder (0, 1,5, 3, 6, 12 och 24 timmar) före cellbehandling, producerades olika aggregationstillstånd av silvernanopartiklar.Därefter utfördes samma MTT-analys som tidigare beskrivits för att utvärdera förändringar i cellviabilitet påverkad av partikelaggregation.Använd GraphPad Prism 7 för att utvärdera det slutliga resultatet, beräkna experimentets statistiska signifikans genom oparat t-test och markera dess nivå som * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01), *** (p ≤ 0,001) ) Och **** (p ≤ 0,0001).
Tre olika storlekar av silvernanopartiklar (AgNP-I, AgNP-II och AgNP-III) användes för antibakteriell känslighet för Cryptococcus neoformans IFM 5844 (IFM; Research Center for Pathogenic Fungi and Microbial Toxicology, Chiba University) och Bacillus Test megaterium SZMC 6031 (SZMC: Szeged Microbiology Collection) och E. coli SZMC 0582 i RPMI 1640-medium (Sigma-Aldrich Co.).För att utvärdera förändringarna i antibakteriell aktivitet orsakade av aggregering av partiklar, bestämdes först deras lägsta hämmande koncentration (MIC) genom mikrospädning i en mikrotiterplatta med 96 brunnar.Till 50 μL standardiserad cellsuspension (5 × 104 celler/ml i RPMI 1640-medium), tillsätt 50 μL silvernanopartikelsuspension och späd i serie två gånger koncentrationen (i det tidigare nämnda mediet är intervallet 0 och 75 ppm, det vill säga, kontrollprovet innehåller 50 μL cellsuspension och 50 μL medium utan nanopartiklar).Därefter inkuberades plattan vid 30°C under 48 timmar, och kulturens optiska densitet mättes vid 620 nm med användning av en SPECTROstar Nano-plattläsare (BMG LabTech, Offenburg, Tyskland).Experimentet utfördes tre gånger i tre exemplar.
Förutom att 50 μL av enstaka aggregerade nanopartikelprover användes vid denna tidpunkt, användes samma procedur som tidigare beskrivits för att undersöka effekten av aggregering på antibakteriell aktivitet på de ovannämnda stammarna.Olika aggregationstillstånd av silvernanopartiklar produceras genom att inkubera partiklarna med 150 mM NaCl under olika tidsperioder (0, 1,5, 3, 6, 12 och 24 timmar) före cellbearbetning.En suspension kompletterad med 50 μL RPMI 1640-medium användes som tillväxtkontroll, medan för att kontrollera toxiciteten användes en suspension med icke-aggregerade nanopartiklar.Experimentet utfördes tre gånger i tre exemplar.Använd GraphPad Prism 7 för att utvärdera det slutliga resultatet igen, med samma statistiska analys som MTT-analysen.
Aggregeringsnivån för de minsta partiklarna (AgNP-I) har karakteriserats, och resultaten publicerades delvis i vårt tidigare arbete, men för en bättre jämförelse screenades alla partiklar noggrant.Experimentdata samlas in och diskuteras i följande avsnitt.Tre storlekar av AgNP.19
Mätningar utförda av TEM, UV-Vis och DLS verifierade den framgångsrika syntesen av alla AgNP-prover (Figur 2A-D).Enligt den första raden i figur 2 visar den minsta partikeln (AgNP-I) en enhetlig sfärisk morfologi med en medeldiameter på cirka 10 nm.Den frömedierade tillväxtmetoden ger också AgNP-II och AgNP-III med olika storleksintervall med medelpartikeldiametrar på cirka 20 nm respektive 50 nm.Enligt standardavvikelsen för partikelfördelningen överlappar inte storlekarna på de tre proverna, vilket är viktigt för deras jämförande analys.Genom att jämföra det genomsnittliga bildförhållandet och tunnhetsförhållandet för TEM-baserade partikel 2D-projektioner, antas det att partiklarnas sfäricitet utvärderas av ImageJs plug-in för formfilter (Figur 2E).43 Enligt analysen av partiklars form påverkas inte deras bildförhållande (stor sida/kortsida av den minsta avgränsande rektangeln) av partikeltillväxt, och deras tunnhetsförhållande (uppmätt area av motsvarande perfekta cirkel/teoretiska yta ) minskar gradvis.Detta resulterar i fler och fler polyedriska partiklar, som i teorin är perfekt runda, motsvarande ett tunnhetsförhållande på 1.
Figur 2 Transmissionselektronmikroskop (TEM) bild (A), elektrondiffraktion (ED) mönster (B), storleksfördelningshistogram (C), karakteristiskt ultraviolett-synligt (UV-Vis) ljusabsorptionsspektrum (D) och genomsnittlig vätskecitrat -avslutade silvernanopartiklar med mekanisk diameter (Z-medelvärde), zetapotential, bildförhållande och tjockleksförhållande (E) har tre olika storleksområden: AgNP-I är 10 nm (översta raden), AgNP -II är 20 nm (mittraden AgNP-III (nedre raden) är 50 nm.
Även om tillväxtmetodens cykliska natur påverkade partikelformen i viss utsträckning, vilket resulterade i den mindre sfäriciteten hos större AgNP: er, förblev alla tre proverna kvasi-sfäriska.Dessutom, som visas i elektrondiffraktionsmönstret i figur 2B, nano. Kristalliniteten hos partiklarna påverkas inte.Den framträdande diffraktionsringen - som kan korreleras med (111), (220), (200) och (311) Miller-indexen för silver - är mycket överensstämmande med den vetenskapliga litteraturen och våra tidigare bidrag.9, 19,44 Fragmenteringen av Debye-Scherrer-ringen av AgNP-II och AgNP-III beror på att ED-bilden tas med samma förstoring, så när partikelstorleken ökar, antalet diffrakterade partiklar per enhetsarea ökar och minskar.
Storleken och formen på nanopartiklar är kända för att påverka biologisk aktivitet.3,45 Formberoende katalytisk och biologisk aktivitet kan förklaras av det faktum att olika former tenderar att föröka vissa kristallytor (som har olika Miller-index), och dessa kristallytor har olika aktiviteter.45,46 Eftersom de preparerade partiklarna ger liknande ED-resultat som motsvarar mycket liknande kristallegenskaper, kan det antas att i våra efterföljande kolloidala stabilitets- och biologiska aktivitetsexperiment bör eventuella observerade skillnader tillskrivas nanopartikelstorlek, inte formrelaterade egenskaper.
UV-Vis-resultaten sammanfattade i figur 2D betonar ytterligare den överväldigande sfäriska naturen hos den syntetiserade AgNP, eftersom SPR-topparna för alla tre proverna är runt 400 nm, vilket är ett karakteristiskt värde för sfäriska silvernanopartiklar.29,30 De fångade spektra bekräftade också den framgångsrika frömedierade tillväxten av nanosilver.När partikelstorleken ökar kommer våglängden som motsvarar den maximala ljusabsorptionen av AgNP-II - mer framträdande - Enligt litteraturen upplevde AgNP-III en rödförskjutning.6,29
När det gäller den initiala kolloidala stabiliteten för AgNP-systemet användes DLS för att mäta den genomsnittliga hydrodynamiska diametern och zetapotentialen för partiklarna vid pH 7,2.Resultaten som avbildas i figur 2E visar att AgNP-III har högre kolloidal stabilitet än AgNP-I eller AgNP-II, eftersom gemensamma riktlinjer indikerar att en zetapotential på 30 mV absolut är nödvändig för långtidskolloidal stabilitet. Detta fynd stöds ytterligare när Z-medelvärdet (erhållet som den genomsnittliga hydrodynamiska diametern för fria och aggregerade partiklar) jämförs med den primära partikelstorleken som erhålls av TEM, eftersom ju närmare de två värdena är, desto mildare är graden av Samling i provet.Faktum är att Z-medelvärdet för AgNP-I och AgNP-II är rimligt högre än deras huvudsakliga TEM-utvärderade partikelstorlek, så jämfört med AgNP-III förutspås dessa prover vara mer benägna att aggregera, där den mycket negativa zetapotentialen åtföljs av en nära storlek Z-medelvärdet.
Förklaringen till detta fenomen kan vara tvåfaldig.Å ena sidan hålls citratkoncentrationen på en liknande nivå i alla syntessteg, vilket ger en relativt hög mängd laddade ytgrupper för att förhindra att den specifika ytan av de växande partiklarna minskar.Men enligt Levak et al., kan små molekyler som citrat enkelt utbytas av biomolekyler på ytan av nanopartiklarna.I detta fall kommer den kolloidala stabiliteten att bestämmas av koronan hos de producerade biomolekylerna.31 Eftersom detta beteende också observerades i våra aggregeringsmätningar (diskuteras mer i detalj senare), kan citratkapsling inte enbart förklara detta fenomen.
Å andra sidan är partikelstorleken omvänt proportionell mot aggregationstendensen på nanometernivå.Detta stöds främst av den traditionella Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO) metoden, där partikelattraktion beskrivs som summan av attraktionskrafter och frånstötande krafter mellan partiklar.Enligt He et al. minskar det maximala värdet för DLVO-energikurvan med storleken på nanopartiklarna i hematitnanopartiklarna, vilket gör det lättare att nå den lägsta primärenergin, vilket främjar irreversibel aggregation (kondensation).47 Det spekuleras dock att det finns andra aspekter utöver DLVO-teorins begränsningar.Även om van der Waals gravitation och elektrostatisk dubbelskiktsrepulsion är likartade med ökande partikelstorlek, en recension av Hotze et al.föreslår att det har en starkare effekt på aggregeringen än vad DLVO tillåter.14 De tror att nanopartiklars ytkrökning inte längre kan uppskattas som en plan yta, vilket gör matematisk uppskattning otillämplig.Dessutom, när partikelstorleken minskar, blir andelen atomer som finns på ytan högre, vilket leder till elektronisk struktur och ytladdningsbeteende.Och ytreaktiviteten förändras, vilket kan leda till en minskning av laddningen i det elektriska dubbelskiktet och främja aggregation.
När vi jämförde DLS-resultaten för AgNP-I, AgNP-II och AgNP-III i figur 3, observerade vi att alla tre proverna visade liknande pH-föranledande aggregering.En kraftigt sur miljö (pH 3) förskjuter provets zetapotential till 0 mV, vilket gör att partiklar bildar mikronstora aggregat, medan alkaliskt pH förskjuter sin zetapotential till ett större negativt värde, där partiklarna bildar mindre aggregat (pH 5 ).Och 7,2) ), eller förbli helt oaggregerad (pH 9).Vissa viktiga skillnader mellan de olika proverna observerades också.Under hela experimentet visade sig AgNP-I vara den mest känsliga för pH-inducerade zetapotentialförändringar, eftersom zetapotentialen för dessa partiklar har reducerats vid pH 7,2 jämfört med pH 9, medan AgNP-II och AgNP-III endast visade A avsevärd förändring i ζ är runt pH 3. Dessutom visade AgNP-II långsammare förändringar och måttlig zetapotential, medan AgNP-III visade det mildaste beteendet av de tre, eftersom systemet visade det högsta absoluta zetavärdet och långsamma trendrörelser, vilket indikerar AgNP-III Mest resistent mot pH-inducerad aggregation.Dessa resultat överensstämmer med de genomsnittliga hydrodynamiska diametermätresultaten.Med tanke på partikelstorleken på deras primrar, visade AgNP-I konstant gradvis aggregation vid alla pH-värden, mest troligt på grund av 10 mM NaCl-bakgrunden, medan AgNP-II och AgNP-III endast visade signifikant vid pH 3 av ansamling.Den mest intressanta skillnaden är att trots sin stora nanopartikelstorlek bildar AgNP-III de minsta aggregaten vid pH 3 på 24 timmar, vilket framhäver dess anti-aggregationsegenskaper.Genom att dividera medelvärdet av Z för AgNP vid pH 3 efter 24 timmar med värdet av det preparerade provet, kan det observeras att de relativa aggregatstorlekarna för AgNP-I och AgNP-II har ökat med 50 gånger, 42 gånger och 22 gånger , respektive.III.
Figur 3 De dynamiska ljusspridningsresultaten från det citratterminerade silvernanopartikelprovet med ökande storlek (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II och 50 nm: AgNP-III) uttrycks som den genomsnittliga hydrodynamiska diametern (Z-medelvärde) ) (höger) Under olika pH-förhållanden ändras zetapotentialen (vänster) inom 24 timmar.
Den observerade pH-beroende aggregationen påverkade också den karakteristiska ytplasmonresonansen (SPR) hos AgNP-proverna, vilket framgår av deras UV-Vis-spektra.Enligt kompletterande figur S1 följs aggregeringen av alla tre silvernanopartikelsuspensioner av en minskning av intensiteten av deras SPR-toppar och ett måttligt rött skifte.Omfattningen av dessa förändringar som en funktion av pH överensstämmer med graden av aggregation som förutspås av DLS-resultaten, men några intressanta trender har observerats.Tvärtemot intuitionen visar det sig att den medelstora AgNP-II är mest känslig för SPR-förändringar, medan de andra två proverna är mindre känsliga.Inom SPR-forskning är 50 nm den teoretiska partikelstorleksgränsen, som används för att särskilja partiklar baserat på deras dielektriska egenskaper.Partiklar mindre än 50 nm (AgNP-I och AgNP-II) kan beskrivas som enkla dielektriska dipoler, medan partiklar som når eller överskrider denna gräns (AgNP-III) har mer komplexa dielektriska egenskaper, och deras resonans. Bandet delas upp i multimodala förändringar .I fallet med två mindre partikelprover kan AgNP betraktas som enkla dipoler och plasman kan lätt överlappa varandra.När partikelstorleken ökar, producerar denna koppling i huvudsak en större plasma, vilket kan förklara den högre känsligheten som observerats.29 Men för de största partiklarna är den enkla dipoluppskattningen inte giltig när andra kopplingstillstånd också kan inträffa, vilket kan förklara den minskade tendensen hos AgNP-III att indikera spektrala förändringar.29
Under våra experimentella förhållanden är det bevisat att pH-värdet har en djupgående effekt på den kolloidala stabiliteten hos citratbelagda silvernanopartiklar av olika storlekar.I dessa system tillhandahålls stabilitet av de negativt laddade -COO-grupperna på ytan av AgNP.Den funktionella karboxylatgruppen i citratjonen protoneras i ett stort antal H+-joner, så den genererade karboxylgruppen kan inte längre ge elektrostatisk repulsion mellan partiklarna, som visas i den översta raden i figur 4. Enligt Le Chateliers princip, AgNP prover aggregerar snabbt vid pH 3, men blir gradvis mer och mer stabila när pH ökar.
Figur 4 Schematisk mekanism för ytinteraktion definierad av aggregering under olika pH (översta raden), NaCl-koncentration (mittenrad) och biomolekyler (nedre raden).
Enligt figur 5 undersöktes även den kolloidala stabiliteten i AgNP-suspensioner av olika storlekar under ökande saltkoncentrationer.Baserat på zeta-potentialen ger den ökade nanopartikelstorleken i dessa citratterminerade AgNP-system återigen ökat motstånd mot yttre påverkan från NaCl.I AgNP-I är 10 mM NaCl tillräckligt för att inducera mild aggregation, och en saltkoncentration på 50 mM ger mycket liknande resultat.I AgNP-II och AgNP-III påverkar 10 mM NaCl inte nämnvärt zetapotentialen eftersom deras värden förblir på (AgNP-II) eller under (AgNP-III) -30 mV.Att öka NaCl-koncentrationen till 50 mM och slutligen till 150 mM NaCl är tillräckligt för att avsevärt minska det absoluta värdet av zetapotentialen i alla prover, även om större partiklar behåller mer negativ laddning.Dessa resultat överensstämmer med den förväntade genomsnittliga hydrodynamiska diametern för AgNP;Z-medeltrendlinjerna uppmätt på 10, 50 och 150 mM NaCl visar olika, gradvis ökande värden.Slutligen detekterades mikronstora aggregat i alla tre 150 mM experimenten.
Figur 5 De dynamiska ljusspridningsresultaten från det citratterminerade silvernanopartikelprovet med ökande storlek (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II och 50 nm: AgNP-III) uttrycks som den genomsnittliga hydrodynamiska diametern (Z-medelvärde) ) (höger) och zetapotential (vänster) ändras inom 24 timmar under olika NaCl-koncentrationer.
UV-Vis-resultaten i tilläggsfigur S2 visar att SPR på 50 och 150 mM NaCl i alla tre proverna har en omedelbar och signifikant minskning.Detta kan förklaras av DLS, eftersom NaCl-baserad aggregering sker snabbare än pH-beroende experiment, vilket förklaras av den stora skillnaden mellan de tidiga (0, 1,5 och 3 timmar) mätningarna.Dessutom kommer en ökning av saltkoncentrationen också att öka experimentmediets relativa permittivitet, vilket kommer att ha en djupgående effekt på ytplasmonresonans.29
Effekten av NaCl sammanfattas i den mellersta raden i figur 4. Generellt kan man dra slutsatsen att en ökning av koncentrationen av natriumklorid har en liknande effekt som att öka surheten, eftersom Na+-joner har en tendens att koordinera sig runt karboxylatgrupperna. undertrycka negativ zetapotential AgNP.Dessutom producerade 150 mM NaCl aggregat i mikronstorlek i alla tre proverna, vilket indikerar att den fysiologiska elektrolytkoncentrationen är skadlig för den kolloidala stabiliteten hos citratterminerade AgNP:er.Genom att beakta den kritiska kondenseringskoncentrationen (CCC) av NaCl på liknande AgNP-system kan dessa resultat på ett smart sätt placeras i relevant litteratur.Huynh et al.beräknat att CCC för NaCl för citratterminerade silvernanopartiklar med en medeldiameter på 71 nm var 47,6 mM, medan El Badawy et al.observerade att CCC för 10 nm AgNP med citratbeläggning var 70 mM.10,16 Dessutom mättes den signifikant höga CCC på cirka 300 mM av He et al., vilket gjorde att deras syntesmetod skilde sig från den tidigare nämnda publikationen.48 Även om det nuvarande bidraget inte syftar till en heltäckande analys av dessa värden, eftersom våra experimentella förhållanden ökar i komplexiteten i hela studien, verkar den biologiskt relevanta NaCl-koncentrationen på 50 mM, särskilt 150 mM NaCl, vara ganska hög.Inducerad koagulering, förklarar de starka förändringarna som upptäckts.
Nästa steg i polymerisationsexperimentet är att använda enkla men biologiskt relevanta molekyler för att simulera interaktioner mellan nanopartiklar och biomolekyler.Baserat på DLS (figur 6 och 7) och UV-Vis-resultat (kompletterande figurer S3 och S4) kan några generella slutsatser hävdas.Under våra experimentella förhållanden kommer de studerade molekylerna glukos och glutamin inte att inducera aggregation i något AgNP-system, eftersom Z-medeltrenden är nära relaterad till motsvarande referensmätvärde.Även om deras närvaro inte påverkar aggregationen, visar experimentella resultat att dessa molekyler är delvis adsorberade på ytan av AgNP.Det mest framträdande resultatet som stöder denna uppfattning är den observerade förändringen i ljusabsorption.Även om AgNP-I inte uppvisar meningsfulla våglängds- eller intensitetsförändringar, kan det observeras tydligare genom att mäta större partiklar, vilket med största sannolikhet beror på den högre optiska känsligheten som nämnts tidigare.Oavsett koncentrationen kan glukos orsaka en större rödförskjutning efter 1,5 timmar jämfört med kontrollmätningen, som är cirka 40 nm i AgNP-II och cirka 10 nm i AgNP-III, vilket bevisar förekomsten av ytinteraktioner.Glutamin visade en liknande trend, men förändringen var inte så tydlig.Dessutom är det också värt att nämna att glutamin kan minska den absoluta zetapotentialen hos medelstora och stora partiklar.Men eftersom dessa zeta-förändringar inte verkar påverka aggregationsnivån, kan det spekuleras i att även små biomolekyler som glutamin kan ge en viss grad av rumslig repulsion mellan partiklar.
Figur 6 De dynamiska ljusspridningsresultaten av citratterminerade silvernanopartikelprover med ökande storlek (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II och 50 nm: AgNP-III) uttrycks som den genomsnittliga hydrodynamiska diametern (Z-medelvärde) (höger) Under yttre förhållanden med olika glukoskoncentrationer ändras zetapotentialen (vänster) inom 24 timmar.
Figur 7 De dynamiska ljusspridningsresultaten från det citratterminerade silvernanopartikelprovet med ökande storlek (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II och 50 nm: AgNP-III) uttrycks som den genomsnittliga hydrodynamiska diametern (Z-medelvärde) ) (höger) I närvaro av glutamin ändras zetapotentialen (vänster) inom 24 timmar.
Kort sagt, små biomolekyler som glukos och glutamin påverkar inte kolloidal stabilitet vid den uppmätta koncentrationen: även om de påverkar zetapotentialen och UV-Vis-resultaten i varierande grad, är Z-genomsnittsresultaten inte konsekventa.Detta indikerar att ytadsorptionen av molekyler hämmar elektrostatisk repulsion, men ger samtidigt dimensionsstabilitet.
För att länka de tidigare resultaten med de tidigare resultaten och simulera biologiska förhållanden mer skickligt valde vi några av de mest använda cellodlingskomponenterna och använde dem som experimentella förhållanden för att studera stabiliteten hos AgNP-kolloider.I hela in vitro-experimentet är en av de viktigaste funktionerna för DMEM som medium att etablera de nödvändiga osmotiska förhållandena, men ur kemisk synvinkel är det en komplex saltlösning med en total jonstyrka som liknar 150 mM NaCl .40 När det gäller FBS är det en komplex blandning av biomolekyler - främst proteiner - ur ytadsorptionssynpunkt har den vissa likheter med de experimentella resultaten av glukos och glutamin, trots den kemiska sammansättningen och mångfalden Sex är mycket mer komplicerat.19 DLS och UV-De synliga resultaten som visas i figur 8 respektive kompletterande figur S5 kan förklaras genom att undersöka den kemiska sammansättningen av dessa material och korrelera dem med mätningarna i föregående avsnitt.
Figur 8 De dynamiska ljusspridningsresultaten från det citratterminerade silvernanopartikelprovet med ökande storlek (10 nm: AgNP-I, 20 nm: AgNP-II och 50 nm: AgNP-III) uttrycks som den genomsnittliga hydrodynamiska diametern (Z-medelvärde) ) (höger) I närvaro av cellodlingskomponenter DMEM och FBS ändras zetapotentialen (vänster) inom 24 timmar.
Spädningen av AgNP av olika storlekar i DMEM har en liknande effekt på kolloidal stabilitet som den som observeras i närvaro av höga NaCl-koncentrationer.Dispersionen av AgNP i 50 v/v% DMEM visade att storskalig aggregation detekterades med ökningen av zetapotential och Z-medelvärde och den kraftiga minskningen av SPR-intensiteten.Det är värt att notera att den maximala aggregatstorleken som induceras av DMEM efter 24 timmar är omvänt proportionell mot storleken på primernanopartiklar.
Interaktionen mellan FBS och AgNP liknar den som observeras i närvaro av mindre molekyler som glukos och glutamin, men effekten är starkare.Z-medelvärdet för partiklarna förblir opåverkat, medan en ökning av zetapotential detekteras.SPR-toppen visade en lätt rödförskjutning, men kanske mer intressant, SPR-intensiteten minskade inte lika signifikant som i kontrollmätningen.Dessa resultat kan förklaras av den medfödda adsorptionen av makromolekyler på ytan av nanopartiklar (nedre raden i figur 4), vilket nu förstås som bildandet av biomolekylär korona i kroppen.49