Наночастинки срібла (AgNP) вважаються потенційно корисним інструментом для боротьби з різними патогенами.Однак існує занепокоєння щодо викиду AgNP в навколишнє середовище, оскільки вони можуть спричинити негативний вплив на здоров’я людини та екологію.У цьому дослідженні ми розробили та оцінили новий магнітний гібридний колоїд (MHC) мікрометрового розміру, прикрашений AgNP різного розміру (AgNP-MHC).Після застосування для дезінфекції ці частинки можна легко вилучити з навколишнього середовища завдяки їх магнітним властивостям і залишатися ефективними для інактивації вірусних патогенів.Ми оцінили ефективність AgNP-MHC для інактивації бактеріофага ϕX174, мишачого норовірусу (MNV) і аденовірусу серотипу 2 (AdV2).Ці цільові віруси піддавали дії AgNP-MHCs протягом 1, 3 і 6 годин при 25 °C, а потім аналізували за допомогою аналізу бляшок і TaqMan ПЛР у реальному часі.AgNP-MHCs були піддані впливу широкого діапазону рівнів pH і водопровідної та поверхневої води, щоб оцінити їх противірусну дію в різних умовах навколишнього середовища.Серед трьох протестованих типів AgNP-MHC Ag30-MHC показали найвищу ефективність для інактивації вірусів.ϕX174 і MNV були знижені більш ніж на 2 log10 після впливу 4,6 × 109 Ag30-MHCs/мл протягом 1 години.Ці результати показали, що AgNP-MHC можна використовувати для інактивації вірусних патогенів з мінімальною ймовірністю потенційного вивільнення в навколишнє середовище.

Завдяки останнім досягненням у нанотехнологіях наночастинки отримують підвищену увагу в усьому світі в галузі біотехнології, медицини та охорони здоров’я (1,2).Завдяки високому відношенню поверхні до об’єму нанорозмірні матеріали, як правило, від 10 до 500 нм, мають унікальні фізико-хімічні властивості порівняно з більшими матеріалами (1).Форму та розмір наноматеріалів можна контролювати, а на їхніх поверхнях можна кон’югувати специфічні функціональні групи для забезпечення взаємодії з певними білками або внутрішньоклітинного поглинання (3,–5).

Наночастинки срібла (AgNP) широко вивчалися як антимікробний засіб (6).Срібло використовується для створення вишуканих столових приладів, для прикраси та в терапевтичних засобах.Сполуки срібла, такі як сульфадіазин срібла та певні солі, використовувалися як засоби для догляду за ранами та для лікування інфекційних захворювань завдяки їх антимікробним властивостям (6,7).Недавні дослідження показали, що AgNP дуже ефективні для інактивації різних типів бактерій і вірусів (8,–11).AgNP та іони Ag+, що вивільняються з AgNP, безпосередньо взаємодіють з фосфор- або сірковмісними біомолекулами, включаючи ДНК, РНК і білки (12,–14).Також було показано, що вони генерують активні форми кисню (АФК), що спричиняє пошкодження мембран мікроорганізмів (15).Розмір, форма та концентрація AgNP також є важливими факторами, які впливають на їхню антимікробну здатність (8,10,13,16,17).

Попередні дослідження також висвітлили кілька проблем, коли AgNP використовуються для контролю патогенів у водному середовищі.По-перше, існуючі дослідження ефективності AgNP для інактивації вірусних патогенів у воді обмежені.Крім того, монодисперсні AgNP зазвичай піддаються агрегації частинок-частинок через їхній малий розмір і велику площу поверхні, і ці агрегати знижують ефективність AgNP проти мікробних патогенів (7).Нарешті, було показано, що AgNP мають різні цитотоксичні ефекти (5,18,–20), і вивільнення AgNPs у водне середовище може призвести до здоров’я людини та екологічних проблем.

Нещодавно ми розробили новий магнітний гібридний колоїд мікрометрового розміру (MHC), прикрашений AgNP різних розмірів (21,22).Ядро MHC можна використовувати для відновлення композитів AgNP з навколишнього середовища.Ми оцінили противірусну ефективність цих наночастинок срібла на MHCs (AgNP-MHCs) за допомогою бактеріофага ϕX174, мишачого норовірусу (MNV) і аденовірусу в різних умовах навколишнього середовища.

Противірусні ефекти AgNP-MHCs у різних концентраціях проти бактеріофага ϕX174 (a), MNV (b) та AdV2 (c).Цільові віруси обробляли різними концентраціями AgNP-MHCs і OH-MHCs (4,6 × 109 частинок/мл) як контроль у струшуючому інкубаторі (150 об/хв, 1 год, 25°C).Для вимірювання вижилих вірусів використовували метод аналізу бляшок.Значення є середніми ± стандартні відхилення (SD) з трьох незалежних експериментів.Зірочки позначають істотно різні значення (P< 0,05 за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу з тестом Даннетта).

Це дослідження продемонструвало, що AgNP-MHC ефективні для інактивації бактеріофагів і MNV, сурогату норовірусу людини, у воді.Крім того, AgNP-MHCs можна легко відновити за допомогою магніту, ефективно запобігаючи вивільненню потенційно токсичних AgNPs у навколишнє середовище.Ряд попередніх досліджень показали, що концентрація та розмір частинок AgNP є критичними факторами для інактивації цільового мікроорганізму (8,16,17).Антимікробні ефекти AgNP також залежать від типу мікроорганізму.Ефективність AgNP-MHCs для інактивації ϕX174 слідувала за співвідношенням доза-відповідь.Серед протестованих AgNP-MHCs Ag30-MHCs мали вищу ефективність для інактивації ϕX174 і MNV.Для MNV лише Ag30-MHCs виявляли противірусну активність, а інші AgNP-MHCs не викликали значної інактивації MNV.Жоден з AgNP-MHC не мав значної противірусної активності проти AdV2.

На додаток до розміру частинок, концентрація срібла в AgNP-MHCs також була важливою.Виявилося, що концентрація срібла визначає ефективність противірусних ефектів AgNP-MHCs.Концентрації срібла в розчинах Ag07-MHCs та Ag30-MHCs при 4,6 × 109 частинок/мл становили 28,75 ppm та 200 ppm відповідно та корелювали з рівнем противірусної активності.Таблиця 2узагальнює концентрації срібла та площі поверхні перевірених AgNP-MHCs.Ag07-MHC показали найнижчу противірусну активність і мали найнижчу концентрацію срібла та площу поверхні, що свідчить про те, що ці властивості пов’язані з противірусною активністю AgNP-MHC.

Наше попереднє дослідження показало, що основними антимікробними механізмами AgNP-MHC є хімічна абстракція іонів Mg2+ або Ca2+ з мікробних мембран, створення комплексів з тіоловими групами, розташованими на мембранах, і генерація активних форм кисню (АФК) (21).Оскільки AgNP-MHCs мають відносно великий розмір частинок (~500 нм), малоймовірно, що вони можуть проникнути через вірусний капсид.Натомість AgNP-MHCs, здається, взаємодіють з поверхневими білками вірусу.AgNP на композитах мають тенденцію зв’язувати біомолекули, що містять тіолову групу, вбудовані в білки оболонки вірусів.Таким чином, біохімічні властивості вірусних капсидних білків є важливими для визначення їх чутливості до AgNP-MHCs.Фігура 1показує різну чутливість вірусів до впливу AgNP-MHCs.Бактеріофаги ϕX174 і MNV були чутливі до AgNP-MHCs, але AdV2 був стійким.Високий рівень стійкості AdV2, ймовірно, пов’язаний з його розміром і структурою.Аденовіруси мають розміри від 70 до 100 нм (30), що робить їх набагато більшими, ніж ϕX174 (27-33 нм) і MNV (28-35 нм) (31,32).На додаток до свого великого розміру, аденовіруси мають дволанцюгову ДНК, на відміну від інших вірусів, і стійкі до різноманітних впливів навколишнього середовища, таких як тепло та ультрафіолетове випромінювання (33,34).Наше попереднє дослідження показало, що майже 3-log10 зниження MS2 відбулося з Ag30-MHCs протягом 6 годин (21).MS2 і ϕX174 мають подібні розміри з різними типами нуклеїнових кислот (РНК або ДНК), але мають однакові швидкості інактивації Ag30-MHCs.Таким чином, природа нуклеїнової кислоти не є основним фактором стійкості до AgNP-MHCs.Натомість розмір і форма вірусної частинки виявилися більш важливими, оскільки аденовірус набагато більший вірус.Ag30-MHCs досягли майже 2-log10 зменшення M13 протягом 6 годин (наші неопубліковані дані).M13 — одноланцюгова ДНК вірусу (35) і має ~880 нм у довжину та 6,6 нм у діаметрі (36).Швидкість інактивації ниткоподібного бактеріофага M13 була проміжною між малими вірусами округлої структури (MNV, ϕX174 і MS2) і великим вірусом (AdV2).

У цьому дослідженні кінетика інактивації MNV суттєво відрізнялася в аналізі бляшок і аналізі RT-PCR (Рис. 2бііc).c).Відомо, що молекулярні аналізи, такі як RT-PCR, значно недооцінюють рівень інактивації вірусів (25,28), як було встановлено в нашому дослідженні.Оскільки AgNP-MHCs взаємодіють переважно з поверхнею вірусу, вони з більшою ймовірністю пошкоджують білки оболонки вірусу, а не нуклеїнові кислоти вірусу.Таким чином, аналіз RT-PCR для вимірювання нуклеїнової кислоти вірусу може значно недооцінити інактивацію вірусів.Вплив іонів Ag+ і генерація активних форм кисню (АФК) повинні відповідати за інактивацію тестованих вірусів.Однак багато аспектів противірусних механізмів AgNP-MHCs все ще неясні, і для з’ясування механізму високої резистентності AdV2 необхідні подальші дослідження з використанням біотехнологічних підходів.

Нарешті, ми оцінили надійність противірусної активності Ag30-MHCs, піддавши їх впливу широкого діапазону значень рН і зразкам водопровідної та поверхневої води перед вимірюванням їх противірусної активності (Рис. 3іі 4).4).Вплив умов із надзвичайно низьким рН призводив до фізичної та/або функціональної втрати AgNP з MHC (неопубліковані дані).У присутності неспецифічних частинок Ag30-MHC постійно виявляли противірусну активність, незважаючи на зниження противірусної активності проти MS2.Противірусна активність була найнижчою в нефільтрованій поверхневій воді, оскільки взаємодія між Ag30-MHCs і неспецифічними частинками в дуже каламутній поверхневій воді, ймовірно, спричинила зниження противірусної активності (Таблиця 3).Тому в майбутньому слід проводити польові оцінки AgNP-MHCs у різних типах води (наприклад, з різною концентрацією солі або гумінової кислоти).

На завершення, нові композити Ag, AgNP-MHCs, мають чудові противірусні можливості проти кількох вірусів, включаючи ϕX174 і MNV.AgNP-MHCs зберігають високу ефективність у різних умовах навколишнього середовища, і ці частинки можна легко відновити за допомогою магніту, таким чином зменшуючи їхній потенційний шкідливий вплив на здоров’я людини та навколишнє середовище.Це дослідження показало, що композит AgNP може бути ефективним противірусним засобом у різних середовищах без значних екологічних ризиків.